導言：作為寫作愛好者，不可錯過為您精心挑選的10篇白貓計劃，它們將為您的寫作提供全新的視角，我們衷心期待您的閱讀，并希望這些內(nèi)容能為您提供靈感和參考。

篇1

“志強，我們公司正缺設計人員，回來和我們一起干吧！”2003年，就在肖志強從美院畢業(yè)后，遠在長沙創(chuàng)辦廣告公司的姐姐、姐夫讓他回去幫忙。盡管留在北京對他有很大的誘惑，但再怎么也是給別人打工，而回長沙就是自己的事業(yè)了，更何況姐姐、姐夫還許諾給他20%的股份。所以，肖志強義無反顧地選擇了回長沙！

幾年前，姐姐和姐夫創(chuàng)辦了“百色”廣告公司，主要設計和平面媒體廣告，在當?shù)匦∮忻麣狻６ぶ緩姷募用烁侨缁⑻硪?，三人分工明確，姐夫執(zhí)掌公司運營，姐姐負責業(yè)務，肖志強則負責廣告設計和制作。三人配合密切，不但令公司成員過著富足的生活，而且公司的名氣節(jié)節(jié)上升。

2004年春節(jié)剛過，姐姐和姐夫就告訴他：他們移民澳洲的申請獲得批準，決定長期在澳洲居住，準備將百色廣告公司交給肖志強一人打理。

獨掌偌大一個公司，肖志強心中有些忐忑，但更多的是豪情萬丈：自己是設計部經(jīng)理，不但在技術方面得心應手、游刃有余，而且作為公司的合伙人，對公司的狀況也了如指掌。自己接管公司，雖然不能在短期內(nèi)突飛猛進，但至少可以讓良好的業(yè)績持續(xù)下去。

然而，令肖志強始料不及的是，上任伊始便出師不利。

姐姐、姐夫離開后，管理、業(yè)務、設計全都由他一手抓，使原本一門心思專注于廣告創(chuàng)意、制作的肖志強，一時間手忙腳亂。

業(yè)務部與設計部的矛盾也在悄悄滋生。2004年初，長沙國際名車展開展。憑著公司原有的知名度，業(yè)務人員力挫眾多對手，取得了幾家汽車廠家的廣告權，但要求嚴格：必須在兩天內(nèi)提供廣告設計樣稿?？尚ぶ緩娒τ诠竟芾恚緹o暇再管理廣告設計。結果，竟有一份在幾次修改后，還是達不到客戶要求而告吹。煮熟的鴨子，飛了！這一次，業(yè)務人員終于忍不住發(fā)難了，指責設計部全是靠他們養(yǎng)活，都是白拿工資的廢物。

盡管以往也有設計部埋怨業(yè)務部反反復復、朝令夕改，業(yè)務部怪罪設計部拖拖拉拉、延誤工期的事情發(fā)生，但當時兩個部門分別由姐姐和自己掌管，底下員工偶有沖突，也不過是發(fā)發(fā)牢騷而已?？涩F(xiàn)在姐姐、姐夫的離開，使兩個部門同時缺失了密切配合的主管，部門間的矛盾便漸漸由小變大、由暗地的互相埋怨轉向公開的相互指責。

設計部為滿足客戶的要求筋疲力盡，業(yè)務部為著履行工期左右為難！

自從他加入公司后，就一直在設計部任職，朝夕相處，使他不自覺地偏袒設計部。潛意識的情感傾斜，很快就造成了重大損失，業(yè)務部的員工漸漸開始消極怠工。

離心容易重建難

發(fā)展受阻慘敗收場

結果，公司業(yè)績一落千丈，不但開發(fā)新客戶受阻，就連老客戶都似乎有慢慢流失的趨勢。這時，肖志強才警覺到自己偏聽偏信的后果。他想維護業(yè)務人員時，又使設計部陷入了備受冷落的狀態(tài)。短短兩個月，公司的消極情緒四處蔓延。

每天，肖志強不僅要負責業(yè)務，還要協(xié)調(diào)好兩部門間的關系，他越來越覺得力不從心。無奈之下，他炒掉了幾個業(yè)績不好、總用理由搪塞的業(yè)務人員，也將設計部里幾個恃才傲物的員工一并“忍痛割愛”了。

這樣，兩部門總可以和平相處了吧？然而，接下來的招聘工作，令肖志強幾乎氣餒。設計部倒還好說，畢竟他知道需要配置什么樣的設計人員，而業(yè)務部的招聘工作卻遠沒有這么順利。開始招進來的一些業(yè)務人員，雖然工作積極，可惜業(yè)績太差，大多數(shù)新進人員在試用期內(nèi)顆粒無收，公司只是白白支付了兩個月的薪水。

為了扭轉局面，肖志強決定降低新進人員的薪水，增加招聘名額，以期全面撒網(wǎng)，重點培養(yǎng)。于是，公司由原來的18人暴增到28人?？雌饋砉居只謴土艘郧拔跷跞寥?、欣欣向榮的光景，但是問題也接踵而至。

由于新員工的數(shù)量很大，直接管理就變得很困難，人員管理逐漸失去了控制。新老員工又存在著明顯的隔閡，公司內(nèi)部逐漸形成了一個個的小團體。同時，由于薪酬水平的降低，招聘的業(yè)務人員素質也隨之降低，個別業(yè)務人員根本無法根據(jù)客戶意圖為客戶設計可行性方案。眾多意向性客戶分布于各行各業(yè)，有些鑒于“百色”的知名度，勉強同意合作，但一段時間后，客戶常常因收不到廣告效果而終止合同。老客戶也因新客戶的良莠不齊對公司失去原有的信賴，漸漸疏于聯(lián)絡。

公司與一家報社的合同馬上就到期了，報社欲對該欄目重新招商，要公司盡快拿出一套新的方案來。那天，肖志強特意主持了員工大會，希望大家獻計獻策。然而，令他吃驚的是，曾經(jīng)可以為一項工作爭論得面紅耳赤的同事們，如今個個相敬如賓，一切唯他馬首是瞻，沒有疑義，也沒有建議。結果一場討論會竟變成了一場氣氛沉悶的個人發(fā)言。

篇2

【關鍵詞】 孕中期; 甲胎蛋白; 游離β人絨毛膜促性腺激素; 臍動脈血流; 多普勒; 不良妊娠結局

Abstract： 【Objective】 To investigate the clinical value of second trimester maternal serum screening and umbilical artery Doppler for prediction of adverse pregnancy outcome. 【Method】 A total of 876 women were taken blood sample during 14 to 21 weeks for the measurement of alpha fetoprotein and free β human chorionic gonadotropin with time-resolved fluorescence assay. Among them， 536 cases were measured the umbilical artery index with color ultrasound Doppler during 14 to 28 weeks. In the end， the pregnancy outcome was record and analyzed. We compared the difference of incidence of adverse outcome between the group of high levels of maternal serum markers (342 cases)， the group of abnormal umbilical artery index (82 cases)， and the group of both maternal serum markers and umbilical artery index were abnormal (40 cases). 【Result】 The high levels of maternal serum markers was significantly associated with preeclampsia， neonatal asphyxia， fetal growth restriction， fetal demise， and abnormal placenta. The incidence of associated adverse outcome was 12.65% in the group of high levels of maternal serum markers， 8.5% in the group of abnormal umbilical artery index， and 30.95% in the group that both maternal serum markers and umbilical artery index were abnormal. The adverse outcome incidence of the last group was significant higher than the former two. 【Conclusion】 High levels of maternal serum markers combine with abnormal umbilical index are associated with higher adverse outcome incidence.

唐氏綜合征(Down?蒺s Syndrome，DS)是活產(chǎn)新生兒最常見的染色體疾病，其血清學產(chǎn)前篩查正在普及。目前我國大部分地區(qū)采用孕中期母體血清標志物甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)、游離β人絨毛促性腺激素(free β human chorionic gonadotropin，free-β-hCG，以下簡稱hCG)二聯(lián)生化指標篩查，以評估胎兒可能患唐氏綜合征、18-三體綜合征、神經(jīng)管缺陷等疾病的風險率。近年來國內(nèi)外研究表明，當不存在染色體異常及胎兒畸形時，母體血清標志物水平的異常升高與不良妊娠結局有著密切的關系[1-3]，于是孕早、中期母血清標志物對于不良妊娠結局的預測意義逐漸成為研究的熱點。但由于僅僅使用血清標志物進行不良妊娠結局的預測存在特異度、陽性預測值不高的缺陷，對臨床的指導意義有限。現(xiàn)階段研究的重點逐漸轉移至開發(fā)新的標志物，即與血清標志物聯(lián)合使用時，能提高預測的效果，提高臨床應用的價值。臍動脈血流與胎兒、胎盤血液循環(huán)密切相關，它反應了胎兒血液灌注情況。國內(nèi)外大量文獻報道臍動脈血流頻譜異常的圍產(chǎn)兒其胎兒窘迫發(fā)生率、新生兒窒息率、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩率及圍產(chǎn)兒死亡率均明顯高于血流正常者[4-6]。母親方面如子癇前期[7]、糖尿病等導致胎盤缺血、缺氧的疾病可以導致臍動脈血流頻譜比值增高[8]。因此，通過對臍血流圖分析，從而了解胎兒、胎盤循環(huán)阻力情況，對高危妊娠的監(jiān)測及胎兒結局預后有重要的臨床價值。臍動脈血流是否能作為與血清標志物聯(lián)合用于評估母兒結局的指標，尚待進一步研究。而目前將血清標志物聯(lián)合臍動脈血流用于監(jiān)測胎兒結局的研究尚處于空白階段。本文旨在探討孕中期血清標志物(AFP、hCG)及臍動脈血流與不良妊娠結局的關系，評價二者聯(lián)合用于預測不良妊娠結局的可能性及意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象

2006 年1月至2009年4月期間在中山大學附屬第三醫(yī)院進行如下檢查的孕婦：妊娠14 ～ 21周血清學篩查(共876例);其中在妊娠14 ～ 28周彩超下行臍動脈血流監(jiān)測(共536例)，并有分娩結局者。納入標準：分娩的胎兒無染色體或結構異常者;單胎妊娠;漢族;排除行產(chǎn)前篩查時已患有本次研究中的產(chǎn)科并發(fā)癥或病理妊娠的孕婦;排除IVF的孕婦;排除與AFP升高有關的疾病，如部分卵巢腫瘤、肝癌等。

1.2 診斷標準

主要觀察的妊娠結局(及妊娠并發(fā)癥)包括：子癇前期;胎兒生長受限;低出生體重兒;新生兒窒息;胎兒丟失;胎盤異常：包括前置胎盤、胎盤早剝、胎盤植入;早產(chǎn);羊水過少;產(chǎn)后出血;妊娠合并貧血;妊娠期糖尿病;胎膜早破;臍帶繞頸;內(nèi)科合并癥：包括肝功能異常、自身免疫疾病、妊娠合并性傳播疾病等。以上妊娠結局(及妊娠并發(fā)癥)的診斷參照樂杰主編的《婦產(chǎn)科學》第6版的標準。

1.3 方法及試劑

1.3.1 試劑及儀器

接受篩查者在孕14 ～ 21周期間，抽取靜脈血2 mL。待自然凝固后分離血清，標本保存于-20 ℃冰箱，于1周內(nèi)收集并由專人檢測。篩查的血清標志物為AFP和Free-β-hCG。血清學分析測定使用廣州市豐華生物工程有限公司生產(chǎn)的AFP和Free-β-hCG試劑盒，檢測儀器采用泰萊Ⅱ型時間分辨熒光免疫分析系統(tǒng)，測定按操作程序嚴格進行質控，測定批內(nèi)變異系數(shù)，不同批次試劑不混用，異常結果重復實驗2次。運用風險評估軟件計算上述兩種標志物的中位數(shù)倍數(shù)(MoM)值，凡AFP≥2.0 MoM和/或hCG≥2.0 MoM的孕婦為血清學標志物升高者。采用珠海艾博羅生物技術有限公司提供的產(chǎn)前篩查軟件系統(tǒng)。

應用PHILIPS公司彩色多普勒超聲診斷儀常規(guī)檢查胎兒，探頭頻率3.5 mHz。選擇臍動脈近胎盤處進行多普勒檢測，取樣容積2.4 ～ 3.6 mm，角度 < 60°，連續(xù)出現(xiàn)3個以上相同波形時，測量S/D、RI、PI數(shù)值并記錄(圖1、2)。臍動脈血流的S/D、RI、PI正常值范圍參照參考文獻[9]。

1.3.2 研究方法

篩選不良妊娠結局：血清學標志物升高者包括單項血清hCG≥2.0 MoM、單項血清AFP≥2.0 MoM及兩項血清標志物水平均升高，分析它們與血清學標志物正常者(hCG及AFP均 < 2.0 MoM)的上述妊娠結局(妊娠并發(fā)癥)的發(fā)生率的差異，差異具有統(tǒng)計學意義的妊娠結局為與血清標志物升高有關的不良妊娠結局。比較血清標志物升高者、臍動脈血流異常者及兩者同時異常者之間相關不良妊娠結局發(fā)生率的差異。

1.4 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均輸入EXCEL表格，采用SPSS 17.0軟件包進行統(tǒng)計學分析。各組數(shù)據(jù)所得結果中，計量資料用x ± s表示，計數(shù)資料用百分率(%)表示。計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料采用四格表?字2檢驗、連續(xù)校正?字2檢驗及Fisher?蒺s精確概率法進行統(tǒng)計。P < 0.05時認為有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 研究人群的一般狀況分析

總例數(shù)876例，其中血清學標志物升高者(以下簡稱升高組) 382例，血清學標志物正常者(以下簡稱正常組) 494例。升高組平均年齡(29.56 ± 3.72)歲，正常組(29.53 ± 3.50)歲，兩者比較P = 0.880 > 0.05，無統(tǒng)計學差異;升高組平均體重(54.39 ± 9.22) kg，正常組(54.73 ± 6.97) kg，兩者比較P = 0.537 > 0.05，無統(tǒng)計學差異;升高組平均篩查孕周(17.82 ± 1.83)歲，正常組(17.90 ± 1.85)歲，兩者比較P = 0.502 > 0.05，無統(tǒng)計學差異。升高組中hCG≥2.0 MoM者285例，AFP≥2.0 MoM者76例，hCG及AFP均≥2.0 MoM者21例。

2.2 相關不良妊娠結局的篩選

比較血清標志物水平升高者(382例)與正常者(494例)之間不良妊娠結局的發(fā)生率。將血清標志物水平升高者中進行分組，分為hCG≥2.0 MoM，hCG≥3.0 MoM，AFP≥2.0 MoM，hCG和AFP同時≥2.0 MoM 4個組。比較4個組與血清標志物正常者之間各種不良妊娠結局及并發(fā)癥的發(fā)生率。當hCG≥2.0 MoM時，子癇前期、新生兒窒息的發(fā)生率與正常者之間的差異有統(tǒng)計學意義;當hCG≥3.0 MoM時，胎兒生長受限及子癇前期的發(fā)生率與正常者之間的差異有統(tǒng)計學意義;當AFP≥2.0 MoM時，子癇前期的發(fā)生率與正常者之間的差異有統(tǒng)計學意義;當hCG和AFP同時≥2.0 MoM時，胎兒丟失、胎盤異常的發(fā)生率與正常者之間的差異有統(tǒng)計學意義。而其他9種不良妊娠結局或妊娠并發(fā)癥的發(fā)生率在血清標志物升高者與正常者之間無明顯差別。因此，與血清標志物升高有關的不良妊娠結局應包括子癇前期、新生兒窒息、胎兒生長受限、胎兒丟失及胎盤異常。

2.3 血清學標志物水平與不良妊娠結局的關系

比較血清學標志物水平升高組與正常組之間的上述篩選出的不良妊娠結局(即子癇前期、新生兒窒息、胎兒生長受限、胎兒丟失及胎盤異常)發(fā)生率的差異。血清學標志物水平升高者，即AFP≥2.0 MoM和/或hCG≥2.0 MoM者，共382例，其中發(fā)生相關不良妊娠結局者有56例，發(fā)生率14.67%;同期檢測的血清學標志物水平正常者，即AFP和hCG均 < 2.0 MoM，共494例，其中發(fā)生相關不良妊娠結局者有25例，發(fā)生率5.06%。兩組發(fā)生率之間具有統(tǒng)計學差異，P值為0.000，OR值3.223，95%置信區(qū)間(1.970-5.272)。

2.4 臍動脈血流異常與不良妊娠結局的關系

在876例孕婦中，共進行536例臍動脈血流監(jiān)測。臍動脈血流異常組，即PI、RI、S/D三項中一項或幾項異常者，共123例，其中發(fā)生上述相關不良妊娠結局者有20例，發(fā)生率16.26%;臍動脈血流正常組，即PI、RI、S/D三項均正常者，共413例，其中發(fā)生上述相關不良妊娠結局者有18例，發(fā)生率4.36%。兩組之間不良妊娠結局發(fā)生率具有統(tǒng)計學差異，P值為0.000，OR值4.261，95%置信區(qū)間(2.175 ～ 8.350)。

2.5 兩指標單項與二者同時異常與不良妊娠結局的關系

進一步比較血清學標志物或臍動脈血流單項異常，與兩者同時異常之間不良妊娠結局的發(fā)生率，分別為43/340(12.65%)、7/82(8.5%)和13/42(30.95%)，可以發(fā)現(xiàn)，單純血清學標志物升高或單純臍動脈血流異常與兩者同時異常者3組之間不良妊娠結局發(fā)生率有統(tǒng)計學差異，P值為0.007。兩兩比較，單純血清學標志物升高與單純臍動脈血流異常的不良妊娠結局發(fā)生率的差異沒有統(tǒng)計學意義，P值為0.301;而血清學標志物升高組、臍動脈血流異常組與兩者同時異常組不良妊娠結局的發(fā)生率的差別具有統(tǒng)計學意義，P值為0.002、0.001。

3 討 論

近年來，一些學者觀察到hCG水平顯著增高的孕婦發(fā)生不良妊娠結局的幾率明顯高于hCG水平正常的孕婦。Ong等[10]測定5584例妊娠10 ～ 14周的母血hCG，然后隨訪妊娠結局，認為異常hCG水平與不良妊娠結局的發(fā)展有關。hCG水平的變化作為監(jiān)測妊娠中母兒危險性的指標，其可能的病理生理基礎為某些病理因素導致胎盤滋養(yǎng)細胞低氧環(huán)境，從而使滋養(yǎng)細胞大量地反應性增生，hCG產(chǎn)生增加，并分泌入血，使母血清中hCG水平升高。

血清AFP值可預測胎血甲胎蛋白值以及胎-母屏障的完整性和通透性。Alkazaleh等學者[11]對孕中期AFP的升高對不良妊娠結局的預測(包括FGR、早產(chǎn)、子癇前期、胎盤早剝)進行研究，認為可能是胎盤缺血-血栓形成而導致胎盤屏障的破壞，使得AFP由胎兒向母體循環(huán)輸送增多的結果。而胎盤缺血-血栓形成可導致胎盤功能不全。Gkogkos 等[12]所做的前瞻性研究表明，中孕期母血AFP≥2.0 MoM時，聯(lián)合其他胎盤功能檢測項目，可有效檢出嚴重胎盤功能不全及相關不良妊娠結局。

當臍動脈血流出現(xiàn)異常，反映了胎兒、胎盤循環(huán)量不足[13]。劉智等[14]研究表明，當胎盤小葉被結扎60%時，臍動靜脈血流均有改變，因此，臍動脈血流反映了胎盤小葉的循環(huán)情況，如出現(xiàn)胎盤病理狀態(tài)，如胎盤水腫、缺血、梗死等，達到一定的嚴重程度時，臍動脈血流將會出現(xiàn)異常改變。

本研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期、胎兒生長受限、胎兒丟失、新生兒窒息及胎盤異常的發(fā)生率在血清標志物升高組與正常組之間的發(fā)生率是存在統(tǒng)計學差異的，而上述不良妊娠結局與胎盤功能不全有密切關系，因此，其病理生理基礎可能為胎盤功能不全引起母血中血清標志物水平升高，而胎盤功能不全最終導致了上述不良妊娠結局。

將血清標志物升高用于預測不良妊娠結局，當兩個標志物同時升高時，其預測不良妊娠結局的OR值最高(51.895)，相關的不良妊娠結局為胎兒丟失。而單個標志物升高預測不良妊娠結局的OR值則較低。因此，當有兩個標志物同時升高時，我們首先應關注胎兒丟失的風險，其次為胎盤異常。

我們發(fā)現(xiàn)在比較不良妊娠結局的發(fā)生率時，使用單一指標血清標志物水平升高及臍動脈血流異常與兩者聯(lián)合相比，差異具有統(tǒng)計學意義，而將三者進行兩兩比較，兩個單一指標與聯(lián)合指標相比，差異均有統(tǒng)計學意義。說明在3種指標中，聯(lián)合指標與不良妊娠結局的關系較兩種單一指標更為密切。因此，將血清標志物與臍動脈血流聯(lián)合用于預測上述不良妊娠結局，其效果應優(yōu)于兩種指標單獨應用。至于其具體篩查效果如敏感度、特異度等，仍需進一步評估。

在臨床工作中，如中孕期唐氏綜合征篩查中血清標志物升高(≥2 MoM)，在排除了染色體及胎兒結構異常后，應密切關注孕14至28周的孕中期臍動脈血流檢測，如有一項或多項指標異常時，與子癇前期、胎兒生長受限、新生兒窒息、胎盤異?；蛱簛G失的不良妊娠結局關系密切，應視為高危妊娠處理，告知患者相關風險，適當增加產(chǎn)前檢查次數(shù)，注意與胎盤功能有關的檢查如彩色多普勒超聲觀察胎盤形態(tài)、復查臍動脈血流等。

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篇3

研究目的：本研究擬在大腸桿菌中表達FimA蛋白并進行蛋白純化。為后續(xù)實驗制備抗FimA蛋白的多克隆抗體提供實驗基礎。

研究方法：1. 以大腸桿菌BL21(DE3)pLysS為宿主菌，用IPTG誘導fimA表達，通過SDS-PAGE和Western blot來驗證蛋白的表達結果，并進行蛋白表達形式分析。2. 大量誘導表達融合蛋白，用Co2+柱親和層析純化表達產(chǎn)物，通過SDS-PAGE和Western blot來驗證純化產(chǎn)物，純化產(chǎn)物經(jīng)透析復性后用BCA法蛋白定量試劑盒作蛋白含量測定。

研究結果：1. 經(jīng)IPTG誘導表達后，工程菌在SDS-PAGE上出現(xiàn)一條新蛋白帶，分子量與預期大小基本一致（約41kDa），IPTG濃度及誘導時間對融合蛋白表達量影響較大：當IPTG濃度為2 mmol/L，誘導時間為3 h時蛋白表達量最大；當IPTG濃度為1 mmol/L，誘導時間為1 h時蛋白表達量最小。6×His-FimA表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE后，轉移至硝酸纖維素膜，X線片感光，在X線片上相應位置呈現(xiàn)陽性結果，可見一明顯蛋白條帶，而空質粒pET-15b對應位置未見特異條帶。蛋白表達形式分析結果表明表達的融合蛋白位于包涵體中。2. 表達產(chǎn)物經(jīng)Co2+柱親和層析， SDS-PAGE上出現(xiàn)一致的單一條帶，其分子量大小與預期相符（約41kDa）。6×His-FimA純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE后，轉移至硝酸纖維素膜，X線片感光，在X線片上相應位置呈現(xiàn)陽性結果，可見一明顯蛋白條帶，條帶位置與BL21(DE3)pLysS全菌誘導表達后相應蛋白位置一致。經(jīng)BCA法蛋白濃度定量試劑盒對純化后的蛋白質進行定量分析，計算出純化后的FimA蛋白濃度為0.96 mg/ml。

主要結論：用本課題組前期構建的fimA基因的原核表達質粒pET-15b-fimA，在大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中誘導表達后，fimA基因能夠得到正確表達。表達產(chǎn)物經(jīng)Co2+柱親和層析，可以得到帶6×His標簽的FimA融合蛋白。

1 緒論

慢性牙周炎是導致成人牙齒功能喪失的主要原因之一，在我國有很高的發(fā)病率，嚴重影響國民健康水平。牙周炎造成的牙周組織的破壞是持續(xù)性的，一旦發(fā)生，目前的治療手段還不能使牙周組織達到完全的恢復。牙周炎還可能是某些系統(tǒng)性疾病的危險因素。隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展、人民生活水平的提高和人群壽命的延長，對牙周健康狀況的關注日益提高。因此，探索預防慢性牙周炎的有效途徑對于提高國民健康水平具有重要意義。

疫苗在人和家畜疾病防治方面具有極大的作用，是一種有效的防治疾病的手段。從減毒活疫苗、死疫苗、亞單位疫苗、重組疫苗到DNA疫苗，由于技術不斷改進，使得疫苗有了廣泛的應用，被成功的用于許多細菌或病毒感染的防治，因此以疫苗來防治牙周炎也已成為一個重要思路。

慢性牙周炎是一種細菌感染性疾病，牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis， Pg)是其主要可疑致病菌[1]。菌毛是Pg表面主要毒力因子之一，菌毛蛋白(fimbrillin，F(xiàn)imA)是其主要亞單位，能夠介導Pg對宿主組織的粘附與入侵，以及與口內(nèi)其他細菌的粘附共聚[1-3]，還能刺激炎性因子的產(chǎn)生[4]。多菌毛Pg野生型菌株可引起定菌大鼠牙槽骨吸收，而無菌毛的突變菌株則不會造成牙槽骨的破壞。也有實驗發(fā)現(xiàn)，用FimA免疫大鼠可減輕由Pg引起的牙槽骨破壞[5]，將抗FimA的單克隆抗體用于口腔被動免疫，可以抑制該菌在口腔的定植[6]。因此，可以將FimA作為防治牙周炎疫苗抗原。

Pg菌毛的單體是FimA，由單拷貝fimA基因編碼。fimA基因全長1290 bp，開放讀框包括1044 bp，編碼347個氨基酸。翻譯后產(chǎn)物菌毛蛋白的功能域（如刺激T細胞和B細胞的位點、刺激細胞因子產(chǎn)生的位點等）位于氨基酸序列的31～331aa不等，各個位點之間可相互交叉或覆蓋。近年來由于分子生物學和免疫學的發(fā)展，fimA基因已被克隆和測序，對蛋白質分子中的各個功能區(qū)、抗原表位已有了更深入的了解，為研制疫苗提供了可靠的依據(jù)。

根據(jù)國內(nèi)外研究進展，在前期已構建fimA原核表達質粒的基礎上，本研究擬在大腸桿菌BL21（DE3）pLysS中表達FimA融合蛋白，并通過金屬螯合親和層析技術進行純化，為后續(xù)實驗制備抗FimA蛋白的多克隆抗體、研發(fā)用于人類的、可有效防治牙周炎的DNA疫苗提供實驗基礎。

2 文獻回顧

牙周炎是口腔疾病中的常見病和多發(fā)病，在我國有很高的發(fā)病率[7]。牙周炎累及牙齒數(shù)目多，預后差，是造成牙齒缺失的主要原因。隨著我國進入老齡化社會，牙周炎的預防將成為突出的保健問題。世界衛(wèi)生組織已將牙周組織健康列為健康人的十項標準之一[7]。探索預防和治療這種嚴重危害人類口腔健康的疾病的方法，對于改善我國人民的口腔健康水平，提高人們的生活質量有著重要意義。

大量的實驗研究、流行病學資料和臨床觀察表明[7]，牙周炎是菌斑微生物引起的感染性疾病。菌斑微生物是引發(fā)牙周炎的始動因子，是造成牙周組織破壞的必須因素。牙周菌斑中絕大多數(shù)細菌為口腔固有菌叢，對宿主無不良影響，僅少數(shù)細菌與牙周炎的發(fā)生、發(fā)展密切相關。其中牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis， Pg）是目前獲得公認的一種牙周致病菌，它是牙周病，尤其是成人慢性牙周炎病變區(qū)或活動部位最主要的優(yōu)勢病原菌，而健康齦溝內(nèi)很少[7， 8]。目前牙齦卟啉單胞菌也是牙周微生物學領域重點研究的厭氧菌之一。除口腔疾病外，在全身系統(tǒng)性疾病的研究中，血清學、動物模型、細胞培養(yǎng)的研究證實[9-11] Pg感染與心腦血管疾病的發(fā)生有關，而且有學者報道[12]Pg的感染與低體重嬰兒的分娩也有關。

Pg含有大量毒性因子，如蛋白酶、菌毛、脂多糖、血凝素等。其中菌毛在牙周致病作用中占據(jù)重要地位，而且與Pg在口腔的定植有關，為Pg的優(yōu)勢抗原之一。另外，因其具有廣泛的生物學活性而成為牙齦卟啉單胞菌研究的一個熱點。

菌毛（pili，fimbriae）是位于革蘭氏陰性菌Pg菌體表面的一種彎曲的、單股的絲狀物，長0.3～1.0 μm，直徑為3.5～5.0 nm，遍布細菌表面，多者每菌可有數(shù)百根，由菌體表面伸向細胞外。其化學組分是一種蛋白質，與細菌的運動無關。

2.1 菌毛的致病機制 2.1.1 介導Pg附著于口腔

Pg附著于宿主組織表面是其定植于口腔的關鍵，也是其致病的先決條件。Pg可選擇性的直接附著于口腔內(nèi)特定部位組織的表面，或識別已經(jīng)附著在組織表面的細菌，然后間接的附著于組織表面。

1）菌毛可介導Pg附著于口腔內(nèi)各種組織細胞的表面

菌毛可介導Pg黏附于齦溝液中的成分（如人血紅蛋白和纖維蛋白原）；唾液中的重要蛋白質成分（如富脯蛋白PRP、富脯糖蛋白PRG、富酪蛋白PRT）；乳鐵轉運蛋白，細胞外基質蛋白（ECM）（如玻連蛋白和纖維連接蛋白）。人細胞外基質蛋白通過與FimA受體配體的結合在細胞外信號轉導中起重要作用。菌毛對基質蛋白有很強的親和力，而且明顯抑制玻連蛋白/纖維連接蛋白與其受體αβ3和配體α5β（在中國倉鼠卵巢CHO細胞株中過度表達）的相互結合。在牙周組織中，菌毛可能通過細胞外基質蛋白受體/配體途徑阻斷細胞外信號轉導。

菌毛還可介導Pg黏附于牙齦上皮細胞、牙周袋上皮細胞、人口腔上皮細胞、人臍靜脈內(nèi)皮細胞、成纖維細胞和巨噬細胞，附著并凝集人或羊的紅細胞等。Umemoto[13]構建了無菌毛的Pg突變株，發(fā)現(xiàn)其對人口腔上皮癌細胞的黏附性和侵襲性均降低，接種小鼠后引起牙槽骨喪失的量也減少。其他學者構建了不表達菌毛的Pg缺陷株，發(fā)現(xiàn)它們黏附和侵襲人牙齦成纖維細胞[14]、上皮細胞[15]、內(nèi)皮細胞[16]和樹突狀細胞[17]的能力也降低，甚至不能黏附。這些研究結果說明菌毛在Pg黏附于口腔上皮細胞的過程中起重要作用。

此外，研究發(fā)現(xiàn)Pg可黏附于唾液覆蓋的羥基磷灰石（hydroxyapatite coated with saliva，sHAP），這種黏附活動常被作為研究Pg與口腔內(nèi)唾液覆蓋的各種組織細胞黏附活動的模型。Lee[18]等的研究發(fā)現(xiàn)，Pg與羥基磷灰石之間的這種黏附活動需要菌毛參與，而且抗菌毛的抗體能完全抑制這種黏附作用。學者們[14， 16]通過同源重組技術滅活fimA基因后，發(fā)現(xiàn)突變株與sHAP的黏附能力降低。這些研究結果提示FimA菌毛蛋白在Pg黏附到唾液覆蓋的口腔內(nèi)各種組織表面的過程中起重要作用。

2）在菌斑形成的早期，菌毛可介導Pg黏附于附著在獲得性膜表面的細菌，間接的附著于組織表面

細菌之間的相互黏附和共聚有助于早期生物膜的形成。鏈球菌是最先定植于牙齒表面的主要細菌，Pg通過菌毛與鏈球菌細胞表面的甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）高親合力、高特異性的結合而與鏈球菌發(fā)生共聚，這種相互作用在Pg定植于牙周袋的過程中可能起重要作用。此外菌毛還參與Pg與放線菌、福賽氏類桿菌之間的黏附過程。

3）有關黏附機制的研究

現(xiàn)在已經(jīng)明確Pg黏附于口腔的過程為一種特異性識別過程，菌毛可能為特異性配體，與宿主細胞膜上的特異性受體相互作用[7]。部分Pg菌毛可識別的黏附受體現(xiàn)已明確，如βintegrins[7，19]、上皮細胞的細胞角蛋白14[20]、巨噬細胞（MCs）上的TLR2和CD14[7]。菌毛通過上皮細胞的βintegrins促進Pg與牙齦上皮細胞的黏附，抗βintegrins的抗體能抑制Pg的黏附和侵襲[19]。Pg菌毛通過單核細胞上的TLR2、CD14和CD11a/CD18，誘導外周血單核細胞IL-6 mRNA的產(chǎn)生、細胞因子的分泌、p38促有絲分裂蛋白激酶磷酸化和NF-κB的活化。小鼠腹膜巨噬細胞的實驗研究表明，β2 integrins（CD11/CD18）是小鼠腹膜巨噬細胞與Pg菌毛黏附的細胞受體；而且β鏈（CD18）在信號轉導中起關鍵作用。

綜上所述，菌毛可介導Pg黏附于齦溝液中的成分（如人血紅蛋白和纖維蛋白原）；人唾液成分（如富脯蛋白PRP、富脯糖蛋白PRG）；乳鐵轉運蛋白、細胞外基質蛋白；宿主細胞（如牙齦上皮細胞、牙周袋上皮細胞、成纖維細胞、人臍靜脈內(nèi)皮細胞，巨噬細胞等）；口腔內(nèi)的細菌（如鏈球菌、放線菌、福賽氏類桿菌）。借助于菌毛黏附于這些物質，Pg可在口腔內(nèi)進一步定植、侵襲、誘導炎癥反應的發(fā)生。

2.1.2 引發(fā)炎癥反應和免疫反應

Pg附著于口腔內(nèi)組織細胞后，其抗原成分和毒性產(chǎn)物等可引發(fā)白細胞的趨化、吞噬等炎癥過程，造成表面組織的損傷——其中Pg菌毛能與脂多糖一起激活宿主的防御機制、誘導多種炎性細胞因子的產(chǎn)生；此外細菌及其產(chǎn)物還通過上皮細胞或者細胞間質進入表層下組織，在組織內(nèi)繁殖，甚至擴散至全身。

1）Pg菌毛的白細胞趨化作用

牙周炎再現(xiàn)了一種重要的中性粒細胞介導的破壞宿主組織細胞的模型。牙周炎的優(yōu)勢病原菌P生的毒力因子主要就是用于調(diào)節(jié)中性粒細胞的反應。其中Pg菌毛能誘導多種可趨化白細胞至炎癥部位的細胞因子的分泌。

Pg菌毛可誘導內(nèi)皮細胞表達趨化因子IL-8（Interleukin-8）和單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1）：感染了野生型Pg的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞持續(xù)低劑量的表達IL-8和MCP-1，而Pg的fimA基因突變株則不能誘導IL-8和MCP-1產(chǎn)生。同時，抗菌毛的特異性抗體也能阻斷上述因子的產(chǎn)生。這些提示IL-8和MCP-1的產(chǎn)生是由菌毛特異性引起的。

IL-8和MCP-1都是誘導白細胞到免疫反應部位的有效的趨化因子。MCP-1又稱單核細胞趨化激活因子（monocyte chemoattractant activating factor， MCAF），它作為趨化因子超家族的一個主要成員，可以由機體多種細胞合成和分泌（如人牙齦上皮細胞），是重要的炎性細胞因子，在機體對入侵的病原微生物的炎癥反應和免疫反應中，起重要調(diào)節(jié)作用。MCP-1的主要生理作用是特異性的趨化中性粒細胞和巨噬細胞向炎癥部位聚集， 同時還有激活巨噬細胞的功能。而且炎癥部位的細胞因子如IL-1、TNF-α等可以刺激機體的免疫細胞及其他細胞表達MCP-1，該過程中所產(chǎn)生的MCP-1能進一步特異性的趨化巨噬細胞和單核細胞向病損部位聚集。中性粒細胞和巨噬細胞向炎癥部位聚集，是炎癥反應中的一個重要過程。巨噬細胞是參與牙槽骨代謝的重要的免疫細胞，被激活的巨噬細胞能產(chǎn)生大量的骨吸收性細胞因子。也有學者認為巨噬細胞是破骨細胞的前體細胞，在破骨細胞分化因子的存在下，體外培養(yǎng)的巨噬細胞可以向破骨細胞分化。而牙槽骨的吸收是牙周病的一個重要病理特點，是病變進程、發(fā)展和愈后的一個重要指標。這些提示Pg菌毛能通過免疫細胞及其他細胞產(chǎn)生的MCP-1間接的趨化巨噬細胞向炎癥部位聚集，增加破骨細胞的數(shù)量，促進破骨細胞的分化和成熟，進而促進牙槽骨的吸收。

Pg菌毛可誘導內(nèi)皮細胞表達粘附分子ICAM-1、VCAM-1和選擇素（selectin）：Pg菌毛誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞表達細胞內(nèi)黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、血管細胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）以及P-selectin/E-selectin。而且加入按照人工合成的菌毛氮末端氨基酸序列多肽能上調(diào)上述分子的表達，而Pg 的fimA基因突變株或含有抗Pg菌毛蛋白抗體的血清與人臍靜脈內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)時，不能誘導上述分子的表達。

內(nèi)皮細胞通過上述分子selectin，ICAM-1和VCAM-1可誘導和趨化血液循環(huán)中的白細胞黏附至內(nèi)皮細胞。其中選擇素是血管粘附分子大家族中的一大類成員，根據(jù)表達部位可分為三類[21]：表達于活化的內(nèi)皮細胞表面的E-selectin；表達于白細胞表面的L-selectin；表達于活化的血小板和內(nèi)皮細胞表面的P-selectin。在感染以及其他炎性反應發(fā)生過程中，selectin通過與其相應配體結合介導白細胞（中性粒細胞、T-和B-淋巴細胞以及單核細胞等）與血管壁（特別是毛細血管后靜脈）接觸，并使白細胞在血管壁上緩慢滾動，從而啟動一系列反應，最終導致白細胞在炎性反應區(qū)域集中。ICAM-1也可促進白細胞黏附、移動和趨化至炎癥部位。血液循環(huán)中的單核細胞和白細胞黏附和趨化至內(nèi)皮細胞，然后穿過內(nèi)皮細胞在局部聚集是炎癥反應的重要過程。Pg菌毛通過誘導內(nèi)皮細胞所表達的selectin、VCAM-1和ICAM-1，趨化單核細胞和白細胞至炎癥反應的局部，可能在牙周病中起重要作用。

2）Pg菌毛誘導多種炎性細胞因子的產(chǎn)生

（1）Pg菌毛誘導外周血單核細胞產(chǎn)生炎性細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和化學趨化因子IL-8，誘導p38促有絲分裂蛋白激酶磷酸化，刺激單核細胞誘導的細胞核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）p50和p65亞單位的活化（通過TLR信號轉導途徑），從而誘導高滴度的NF-κB依賴性細胞因子的釋放。NF-κB是細胞中一個重要的轉錄調(diào)節(jié)因子，是Rel家族的成員，幾乎存在于所有細胞中，在免疫反應、應激反應、細胞凋亡及病毒復制的調(diào)節(jié)中起主導作用，可在炎癥部位高度表達，提示其在免疫反應和炎癥反應中起著關鍵作用。受NF-κB調(diào)節(jié)的炎性細胞因子有：腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF-α和TNF-β）；粘附分子（ICAM-1，VCAM，E-selectin）；白介素（IL-1，IL-2，IL-6，IL-8，IL-12）；集落刺激因子（CSF）（粒細胞-CSF，粒細胞和單細胞-CSF）；β-干擾素（INF-β）等。因此，NF-κB是多種促炎癥基因高度轉錄的必須因子。同時，由NF-κB調(diào)節(jié)的產(chǎn)物，如TNF-α和IL-1β又能激活NF-κB，這就意味著存在一個能放大且延續(xù)炎癥反應的復雜的調(diào)節(jié)環(huán)路。

（2）Pg菌毛還能通過TLR2信號途徑誘導小鼠腹膜巨噬細胞產(chǎn)生RANTES、INF-γ、IL-17、VCAM-1、血管內(nèi)皮細胞生長因子，誘導MCP-1 mRNA的強表達。CD18可能在相關的信號轉導機制中起重要作用。Pg菌毛可誘導巨噬細胞樣細胞株U937表達IL-1β，IL-8，IL-12和TNF-α。fimA基因正常表達的Pg菌株能誘導單核細胞來源的樹突狀細胞表達炎性細胞因子TNF-α、IL-6，免疫調(diào)節(jié)細胞因子IL-10和趨化因子IL-8，而fimA基因的突變菌株Pg DPG3就不能誘導上述細胞因子的表達。而且用菌毛蛋白刺激單核細胞來源的樹突狀細胞，能在自體混合淋巴細胞反應（MLR）和自體的CD4+ T細胞中誘導以IFN-γ為主要細胞因子的Th1-型免疫反應。

關于菌毛誘導各種炎性細胞因子的產(chǎn)生的機制，Hajishengallis[22]的研究表明：體內(nèi)免疫系統(tǒng)的Toll-like receptors（TLRs）和其他模式識別受體（pattern-recognition receptors，PRRs）組成了一種功能性受體復合物，識別并對病原菌相關模式分子（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）起反應。在這種相互作用中，菌毛作為一種病原菌相關模式分子與宿主細胞的模式識別受體復合物相結合。CD14和CD11b/CD18是一種募集性受體，TLRs則是一種信號轉導受體。TLR2和TLR4與介導菌毛活化細胞有關，其他的模式識別受體如CD14和CD11b/CD18與介導細胞對菌毛的識別有關。菌毛通過激活TLR信號轉導途徑，誘導單核細胞產(chǎn)生炎性細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和化學趨化因子IL-8，并誘導抗原呈遞細胞中協(xié)同刺激性分子CD40、CD80和CD86表達的上調(diào)。此研究結果也提示菌毛對宿主免疫系統(tǒng)有潛在的“危害”。

3）Pg菌毛誘導多種與調(diào)節(jié)骨代謝有關的細胞因子的產(chǎn)生，改變牙槽骨的代謝，誘導骨的吸收

Pg菌毛所誘導產(chǎn)生的細胞因子如IL-1、TNF-α是骨重建中重要的局部調(diào)節(jié)因子，在牙槽骨的吸收破壞中起重要作用，可促進結締組織基質的降解，刺激骨的吸收，與牙周炎密切相關[1]；IL-1、IL-8、TNF-α等細胞因子還可通過自分泌和旁分泌途徑，刺激更多的IL-1、IL-8、TNF-α的產(chǎn)生，使炎癥加重和擴大，引起組織的進一步破壞。提純的菌毛蛋白還能濃度依賴性的誘導肝細胞生長因子HGF/SF的產(chǎn)生。HGF/SF，也名為趨化因子SF，由間充質細胞產(chǎn)生，主要作用于上皮細胞，與刺激破骨細胞的活化有關。

Evans[23]研究發(fā)現(xiàn)表達菌毛的Pg能誘導無菌鼠牙槽骨喪失，而不產(chǎn)生菌毛的Pg誘導無菌鼠牙槽骨喪失的能力顯著降低，而且用提純的菌毛蛋白免疫無菌鼠可預防Pg所導致的牙周組織的破壞。這也證實了菌毛與牙槽骨的吸收密切相關。

4）Pg菌毛抑制單核細胞和巨噬細胞的凋亡

單核細胞和巨噬細胞的凋亡可能與慢性炎癥性疾病密切相關。在缺乏生長因子的培養(yǎng)液中，Pg菌毛蛋白可抑制人單核細胞THP-1的凋亡。這種抑制作用能被抗菌毛蛋白的抗體所完全抑制。菌毛可激活細胞外信號傳導激酶（signal-regulated kinase，ERK），刺激細胞內(nèi)依賴細胞周期的蛋白激酶抑制劑p21的表達，從而阻斷單核細胞和巨噬細胞的凋亡，提示菌毛可阻斷單核細胞和巨噬細胞的凋亡，是慢性炎癥性疾病牙周病的一種重要的調(diào)節(jié)分子。

5）Pg菌毛誘導免疫反應

慢性牙周炎與牙齦卟啉單胞菌感染不成熟樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）、誘導真皮下DCs和基底膜中成熟的DCs數(shù)量的增加有關。Jotwani[24]的研究證實fimA基因正常表達的菌株Pg381與fimA基因的突變菌株PgDPG3相比，能更高效進入單核細胞來源的樹突狀細胞（monocyte-derived dendritic cells，MDDCs）中，誘導DCs的成熟。Pg381感染MDDCs后，能誘導高水平的自體混合淋巴細胞反應，誘導Th1-型免疫反應。用菌毛蛋白刺激MDDCs，也能誘導DCs成熟，而且成熟的MDDCs還能誘導自體同源性CD4+T細胞的增殖，γ-干擾素（gamma interferon，IFN-γ）的釋放。這些結果提示Pg菌毛可能在誘導MDDCs吞噬Pg和誘導Th1-型免疫反應中起重要作用。

Amano[25]報導在牙周炎病人體內(nèi)能檢測到高滴度的抗菌毛的特異性IgG和IgA抗體。Condorelli[26]報導在牙周炎病人71.7%活動性位點和58.7%非活動性位點的齦溝液（gingival crevicular fluid ，GCF）中能檢測到抗Pg菌毛的特異性IgA抗體，而在健康對照組的所有位點的GCF中均不能檢測到抗菌毛的特異性IgA抗體。這些流行病學研究的結果表明Pg菌毛具有良好的免疫原性，能在體內(nèi)誘發(fā)免疫反應。

Pg菌毛所誘導的免疫反應具有保護作用：Evans[23]等用提純的菌毛蛋白和一種人工合成的20個氨基酸的菌毛多肽免疫無菌鼠后，鼠血清中抗菌毛的特異性抗體滴度較用全菌免疫后鼠血清中的抗體滴度高3～4倍。當給無菌鼠口腔接種Pg后，菌毛免疫鼠的牙周組織未受到破壞。Yanagita[27]以菌毛蛋白鼻腔黏膜免疫小鼠（霍亂毒素CT為免疫佐劑），能在黏膜效應組織（包括鼻腔通道，頜下腺）的CD4+T細胞誘導Th1-/Th2-型免疫反應。而且頜下腺產(chǎn)生的抗原特異性的IgA多克隆抗體可抑制Pg黏附于上皮細胞，減少上皮細胞細胞因子的產(chǎn)生。提示菌毛是一種有潛力的研制牙周炎疫苗的候選免疫原。

6）Pg菌毛誘導泡沫細胞的形成

有學者報導Pg的感染與動脈粥樣硬化[28]的發(fā)生有關。動脈粥樣硬化是一種由血管壁開始的慢性炎癥性反應，其中泡沫細胞的形成是其重要特點。Giacona[28]研究證實人體巨噬細胞在感染野生型Pg后，形成泡沫細胞的量明顯增加，但是感染fimA基因的突變菌株Pg DPG3后沒有明顯的變化，提示菌毛是Pg誘導泡沫細胞形成的必須因素，Pg菌毛可能與動脈粥樣硬化的發(fā)生有關。

2.2 有關fimA基因表達調(diào)控的研究進展

Pg fimA基因的表達途徑有以下三種[29]（按照表達和裝配系統(tǒng)分類）：陪伴/引導分子途徑系統(tǒng)、第二分泌系統(tǒng)、核化依賴聚合系統(tǒng)。fimA基因表達的初始產(chǎn)物具有非常長的前序列。Pg蛋白酶參與fimA基因的翻譯后處理、轉運和裝配[29]。fimA基因的表達還受到以下因素的影響。

1）局部理化環(huán)境對Pg fimA基因表達的影響

研究表明[30]，Pg fimA基因的表達及菌毛依賴性表型的活性均受到溫度、離子濃度等環(huán)境條件的影響。

齦下區(qū)的溫度并不恒定，常隨牙齒部位及炎癥程度而變[31]，健康齦下區(qū)溫度一般在34℃～37℃，而炎性牙周袋內(nèi)溫度　可達39℃。Xie等[32]通過fimA啟動子-lacZ受體基因融合研究環(huán)境因素對Pg fimA基因表達的影響時，發(fā)現(xiàn)當齦下區(qū)溫度由34℃升至39℃時，Pg fimA基因表達可減少至1/10。Murakami等[33， 34]的研究同樣證實溫度升高時，基因fimA的表達水平降低。Amano等[35]報導溫度從37℃提高到39℃時，Pg對唾液成分和鏈球菌的黏附能力降低，Pg在牙周炎病人的血清中的抗原性發(fā)生改變。溫度影響DNA的超螺旋結構，改變組蛋白與DNA結合的活性[36]，從而降低基因轉錄的速度[37]。Pg根據(jù)溫度的變化來調(diào)整fimA基因表達的水平，可能是在機體感染Pg早期，fimA基因表達水平較高，有利于Pg黏附及侵入牙周組織；隨著炎癥程度加重、牙周袋形成和局部溫度升高，菌毛的產(chǎn)生受到遏制，從而使菌毛的某些功能特性發(fā)生改變，而有利于Pg的生存。

基因fimA的表達還在轉錄水平受氯化高鐵血紅素濃度的調(diào)節(jié)[38]。鐵在Pg的生長繁殖和毒力中起關鍵作用，Pg以血紅素的形式吸收鐵[39]。McKee[40]等發(fā)現(xiàn)，Pg在氯化高鐵血紅素過量時，毒力增強。在氯化高鐵血紅素不足時，Pg生長速度降低，Pg菌體表面菌毛數(shù)量減少[40]，血凝素基因hagB和hagC的mRNA表達水平降低[41]，但是，致病因子如溶血素和胰蛋白酶樣蛋白酶等的數(shù)量及其致病毒力均明顯增加[42， 43]。為進一步闡明氯化高鐵血紅素在調(diào)節(jié)fimA基因表達中的作用，Xie等[38]研究了fimA基因的轉錄活性，結果顯示在缺乏氯化高鐵血紅素的情況下，fimA啟動子活性降低50%，表明氯化高鐵血紅素可以對Pg fimA基因表達起正調(diào)控作用。但是這種調(diào)控作用不如溫度變化對其影響的程度明顯。雖然在氯化高鐵血紅素缺乏時，Pg的生長速度降低，但此時fimA啟動子活性降低與Pg生長速度的降低并沒有直接的聯(lián)系[38]，fimA啟動子的活性并不依賴于Pg的生長階段。氯化高鐵血紅素調(diào)節(jié)Pg fimA基因表達的具體分子機制仍不清楚，許多受離子調(diào)控的基因在其啟動子區(qū)均存在“離子盒”，而在fimA啟動子區(qū)并沒有與此具有同源性的區(qū)域結構[44]。推測可能是由于Pg多種致病因子基因的表達共同受到氯化高鐵血紅素的調(diào)節(jié)所致。

影響Pg fimA基因表達的局部理化環(huán)境還包括血清、唾液、滲透壓、Ca2+濃度以及pH值等。

關于Pg如何感受到環(huán)境的變化，并把這種信息傳遞給細胞的機理并不完全清楚。但是研究發(fā)現(xiàn)信號轉導系統(tǒng)的兩種成分FimS-FimR與Pg fimA基因的表達有關[45]。FimS是一種組氨酸蛋白激酶基因的等位基因，F(xiàn)imR是反應調(diào)節(jié)基因的等位基因[45]。FimS 和FimR的分裂會導致菌毛形成量的明顯降低。fimA基因的表達可能受到FimR反應調(diào)節(jié)器的正調(diào)控[46]。FimR調(diào)控包括fimA基因位點周圍的5個成串的基因——fimA cluster在內(nèi)的多個基因的表達。染色體免疫沉淀反應和電泳分析表明，菌毛蛋白黏附到fimA cluster中的第一個基因的啟動子區(qū)域。突變菌株的基因表達分析表明，fimA基因轉錄過程包括多個步驟，F(xiàn)imR基因上調(diào)fimA cluster中的第一個基因的表達，而此基因編碼一個在fimA基因的表達中起關鍵作用的調(diào)控蛋白。

2）其他口腔微生物對Pg fimA基因表達的調(diào)控

牙菌斑是一種附著了各種細菌的生物膜，這些菌斑微生物之間可以通過細胞間信號轉導機制互相影響。Pg通過與獲得性薄膜中的唾液分子[25]或者先前定殖的細菌如口腔鏈球菌[1]相接觸而定殖于牙菌斑生物膜中，然后與牙菌斑生物膜中的其他微生物共生。但是，Pg不能聚集于鏈球菌突變株或者S.cristatus這一底層的上面[47]。針對這一現(xiàn)象的進一步研究揭示鏈球菌S.cristatus CC5A能明顯降低Pg的fimA基因的表達水平，其濃度與fimA基因表達水平呈負相關，濃度升高時甚至可使fimA啟動子活性下降1/2[48]。但是，在實驗中尚未發(fā)現(xiàn)菌斑中的其他細菌，如纖細鏈球菌G9B和M5、血鏈球菌10556、變形鏈球菌KPSK2、內(nèi)氏放線菌NC-3、齒垢密螺旋體GM-1以及具核梭桿菌10953等對fimA基因的表達具有這種調(diào)控作用[49]。

目前的研究結果認為，S.cristatus CC5A與Pg之間的這種信號轉導開始于Pg受體對CC5A信號的識別[47]。信號分子是鏈球菌S.cristatus細胞膜表面的一種分子量為59kDa的CC5A蛋白，與其他革蘭氏陽性菌分泌的短信號肽有明顯區(qū)別[49]。菌毛自身并非受體，fimA基因突變的Pg株與CC5A蛋白的結合與野生型Pg菌株與CC5A蛋白的結合沒有區(qū)別。這些結果表明，早期共生菌斑和后期致病性菌斑中的許多細菌并不影響fimA啟動子轉錄的活性，不影響Pg菌毛的產(chǎn)生，因而能夠與Pg相互共存。但是，S.cristatus CC5A能特異性地使Pg fimA表達水平降低，從而影響菌毛的產(chǎn)生，阻止Pg在菌斑內(nèi)的進一步的繁殖。

3）Pg自身產(chǎn)物對fimA基因表達的調(diào)控

目前，定點誘變試驗表明[50]，在fimA基因上游區(qū)域存在一個σ70-識別的RNA聚合酶結合位點，研究證明，調(diào)節(jié)蛋白能夠與此位點特異性的結合，從而影響RNA聚合酶的功能。Xie等[48]發(fā)現(xiàn)有三種蛋白可結合于fimA基因，分別是菌毛蛋白、賴氨酸蛋白酶（Kgp）以及精氨酸蛋白酶（Rgp）的翻譯后處理片段。

將外源fimA啟動子-LacZ受體插入攜帶fimA突變基因的Pg菌株內(nèi)，結果發(fā)現(xiàn)插入的外源性fimA啟動子不能活化，fimA mRNA表達水平低；但若僅使fimA結構基因上游區(qū)域產(chǎn)生突變，則不影響啟動子的活性，fimA mRNA的表達水平與野生型菌株相同[48]。提示fimA基因在表達過程中，表達產(chǎn)物可作為調(diào)節(jié)蛋白與自身啟動子上游區(qū)的RNA聚合酶結合位點結合，從而正反饋性調(diào)節(jié)Pg fimA基因的表達。

Pg的半胱氨酸蛋白酶（Rgp和Kgp）也參與調(diào)節(jié)fimA基因的表達。有研究[51]報道當rgp表達水平較低時，Pg表面菌毛數(shù)量減少。rgpA和kgp基因失活的Pg菌株YPP1和YPP2與野生型Pg相比，fimA mRNA表達水平明顯降低[52]。Pg 381的rgp A基因突變的變異株不表達菌毛，rgpB基因變異菌株表達的菌毛水平較野生型菌株低[48]。Tokuda[53]等也證明rgpA單基因突變菌株的fimA mRNA表達水平下降，表達的菌毛蛋白很少，通過Western印跡分析不能檢出菌毛蛋白，其表面的菌毛通過電鏡也無法觀測到。菌株Pg 33277 的rgpA和rgpB雙基因缺陷變異菌株則不表達菌毛[48]。這些研究結果均證明蛋白酶可在轉錄水平直接影響菌毛蛋白的產(chǎn)生。此外，在菌毛蛋白翻譯后修飾加工的過程中，Pg蛋白酶還參與到對菌毛蛋白N-末端氨基酸的修飾加工。

這些資料均表明包括菌毛蛋白、Rgp和Kgp蛋白酶在內(nèi)的幾種Pg來源的蛋白都是fimA基因表達調(diào)控系統(tǒng)的組成部分，它們能夠與fimA基因的上游區(qū)域結合，從而影響fimA基因的mRNA表達水平。

綜上所述，影響Pg fimA基因表達的因素有：局部理化環(huán)境，包括溫度、氯化高鐵血紅素的濃度、血清、唾液、滲透壓、Ca2+濃度以及pH值等；牙菌斑中的細菌如S.cristatus CC5A；Pg自身產(chǎn)物，如菌毛蛋白、Rgp和Kgp蛋白酶等。如能對fimA基因的表達過程詳細研究，在fimA基因轉錄的過程中加以某種干預，使Pg菌毛蛋白的轉錄、翻譯水平降低，或者使fimA基因翻譯后的修飾加工過程受到干擾，使菌毛所介導的Pg的黏附、侵入降低，病理性作用減少，就有可能降低Pg相關性牙周炎的發(fā)病率和嚴重性，這也是未來的一個研究方向。

2.3 有關fimA基因分子克隆的研究進展

Dickinson等[54]1988年首次克隆并測序了Pg381 fimA基因。Fujiwara等[55]1993年克隆并測序了9種Pg菌株的fimA基因，結果揭示這9種Pg菌株的fimA基因覆蓋1044～1083 bp，所編碼的多肽分子量為37，527～38，239，菌株之間有一部分相同的序列，同時具有大量的不同序列。Fujiwara[55]首次按照fimA基因核苷酸序列的不同，將Pg分為4種基因型。

Sharma等[56]1993年首次用表達載體pET-lld，大腸桿菌BL21表達了Pg 2561的部分菌毛多肽（氨基酸10～337）。Washington等[57]1993年用表達載體pET-lld，大腸桿菌BL21表達了Pg 381 fimA的一部分片段（1 kb）（fimA基因全長為1044bp）。

Sharma等[58]1996年首次構建了表達部分菌毛多肽的重組鏈球菌——一種活載體疫苗。以pUC13Bg12.1為模板，將編碼Pg 2561 FimA蛋白部分肽段（N-末端55～145[90個aa]和C-末端233～322殘基[89個aa]）的基因，PCR擴增后，定向插入到鏈球菌（Streptococcus gordonii）M6基因（emm6.1）的Kpn I-Hind III位點，獲得融合表達質粒pSMB55，然后轉染于口腔鏈球菌（S. gordonii GP251）中，制備為一種以細菌為載體的基因工程減毒活疫苗。在鏈球菌M6蛋白（氨基酸1～122和302～441）的錨定區(qū)，表達菌毛多肽（氨基酸55～145和233～322），形成一種融合蛋白。此鏈球菌所表達的菌毛多肽可競爭性的抑制Pg結合于唾液覆蓋的羥基磷灰石上。而且將此疫苗菌株口腔內(nèi)免疫無菌鼠后，可誘導血清異性IgA、IgG抗體和唾液異性IgA抗體的產(chǎn)生，并能防止Pg所導致的牙槽骨的吸收[59]。Sharma等[60]1999年進一步在鏈球菌Streptococcus gordonii表面，表達FimA蛋白的C-末端多肽（226～246），但是實驗證實這種包含游離半胱氨酸殘基的多肽在鏈球菌的表面表達很弱。

Kawabata等[61]1999年以克隆質粒pSM36為模板克隆了fimA基因，以真核表達質粒pcDNA3首次構建了fimA核酸疫苗pcDNA3/fimA。體外轉染NIH3T3真核細胞后，可檢測到菌毛蛋白的表達，說明了在真核細胞中表達FimA蛋白的可行性。定向唾液腺（TSG）免疫BALB/c小鼠后，成功的誘導了體液免疫和細胞免疫，在唾液和血清中能檢測到特異性抗體。免疫后的小鼠，血清中抗FimA特異性IgG抗體主要的亞類是IgG2a，唾液腺單核細胞Th2-型細胞因子特異性mRNA增加，脾中產(chǎn)生抗原特異性的細胞毒性T淋巴細胞。

Shin等[62]2005年首次報道在植物中表達菌毛多肽。Shin等[62]克隆FimA蛋白的C-末端氨基酸殘基266～337的編碼基因，然后插入到植物的表達載體中編碼CTB（霍亂毒素B亞單位）的基因片段的下游，然后此嵌合性載體ctb-fimA被轉染到馬鈴薯（Solanum tuberosum）細胞中表達蛋白。通過ELISA對CTB-FimA融合蛋白的定量分析表明，此蛋白占全部可溶性蛋白的0.33%，表達量較低，尚需要進一步改進。

國內(nèi)劉魯川[63]1994年首先以pUC13Bg12.1質粒為模板，PCR擴增fimA基因部分片段（504～1045 bp，總擴增長度為542 bp）。

郭紅梅[64]2007年成功的構建了FimA蛋白與IL-15真核共表達質粒，以其作為DNA疫苗經(jīng)滴鼻免疫Wistar大鼠，能夠激發(fā)　機體產(chǎn)生特異性的系統(tǒng)免疫應答，又能激發(fā)粘膜免疫應答。疫苗所表達的IL-15可以作為輔助因子增強sIgA應答，對Pg引起的實驗性牙周炎提供有效的保護，為解決增強sIgA應答來對牙周組織提供保護的難題提供思路。

2.4 有關大腸桿菌表達系統(tǒng)

2.4.1 大腸桿菌表達系統(tǒng)

大腸桿菌表達系統(tǒng)是目前最常用的外源蛋白表達系統(tǒng)[65] 。大腸桿菌系統(tǒng)由于其遺傳學、生物化學和分子生物學方面已充分被人們了解，而且有大量可供選擇的克隆載體與表達載體，已經(jīng)成為表達許多異源蛋白質的首選表達系統(tǒng)[66，71]。大腸桿菌遺傳圖譜明確，容易培養(yǎng)且費用低，對許多蛋白質有很強的耐受能力，能高水平的表達這些蛋白質。但是，在實際工作中，常常需要使外源基因得到最佳的表達，以滿足人們各種研究需要。此外，許多外源基因在大腸桿菌胞內(nèi)表達時，往往不能自發(fā)折疊卷曲生成有一定空間結構的特定功能的蛋白質，而是以一種不溶性的沉淀即包涵體的形式存在于細胞內(nèi)[67 ，68 ] 。包涵體的形成在某種程度上限制了大腸桿菌表達系統(tǒng)的應用。由于處于包涵體中的重組蛋白沒有生物活性，為使重組蛋白具有生物活性，必須將包涵體復性，而包涵體的變性、復性一直困擾著許多科學工作者[69，70] 。

2.4.2 在大腸桿菌中表達外源蛋白的優(yōu)化[71]

1）翻譯效率的優(yōu)化：啟動

有效啟動翻譯需要起始密碼上游的核糖體結合位點。翻譯起始過程中，5～9個核苷酸長的Shine-Dalgarno序列與16S RNA的3'末端發(fā)生作用。Shine-Dalgarno序列與起始密碼ATG之間的距離對翻譯效率有影響，在ATG下游插入開放閱讀框架的載體，此段距離已經(jīng)優(yōu)化，如果克隆基因以自身的ATG起始翻譯，起始密碼應位于Shine-Dalgarno序列下游5～7個核苷酸。

翻譯起始區(qū)的二級結構也影響基因表達效率。Chen等通過改變Shine-Dalgarno序列上、下游的核苷酸，減少二級結構的形成，提高了基因表達水平。與此類似，也有一些基因通過共翻譯，也就是在一段翻譯序列的下游插入目的基因編碼序列，提高了表達水平。

2）密碼子的使用

遺傳密碼與氨基酸并不是一對一的關系，61種密碼子編碼20種氨基酸，而其中只有兩種是由單一密碼子編碼的，其余的18種中的每一種都有多個密碼子，編碼同一種氨基酸的不同密碼子的使用頻率也是不同的。

如果編碼區(qū)中有大量的或成串兒的稀有密碼子，通過突變或基因重合成去除這些稀有密碼子，可以提高表達水平。另外，如果靶序列中有稀有密碼子AGA或AGG，會帶來一些特殊問題，因為它們在編碼區(qū)內(nèi)部又形成額外的Shine-Dalgarno序列。

編碼外源蛋白氨基酸的序列對表達水平也有很大影響。因此有必要用聚合酶鏈反應（PCR）或定點突變的方法，把表達基因N端的7～8個密碼子變成大腸桿菌中最常用的密碼子。還應盡可能通過這些方法將靶基因5'端（G+C）含量降至40％以下。

3）培養(yǎng)條件優(yōu)化

在表達系統(tǒng)相同的情況下，不同的培養(yǎng)基常導致表達水平的巨大差異。LB類標準培養(yǎng)基可以用于建立表達的基本參數(shù)，但只有對培養(yǎng)條件進行優(yōu)化后，才能獲得最佳表達，包括使用基本鹽培養(yǎng)基，如M9，限定鹽培養(yǎng)基，如誘導培養(yǎng)基，或豐富培養(yǎng)基，如肉湯、YT或NZCYM。

一些培養(yǎng)基添加劑能提高某一種特定蛋白的表達水平。這其中包括濃度在0.1～0.5 mol/L之間的NaCl、不可代謝糖如蔗糖（0.2～0.6 mol/L）、輔助因子（血紅素）和抗生素。Lee和Beckwith注意到，分泌途徑缺陷的抑制基因位于與蛋白質合成有關的基因上，這些抑制突變的最終效果是降低蛋白合成速率，而低濃度抗生素能在大腸桿菌中模擬它的作用。表達外源蛋白尤其是分泌蛋白時，在培養(yǎng)基中加入抗生素，如氯霉素（1 μg/ml）和四環(huán)素（0.1 μg/ml），能降低蛋白合成速率，防止分泌系統(tǒng)過載，分泌蛋白也就更容易與伴侶分子等結合，折疊成天然構象。最后，培養(yǎng)基的pH也能影響外源蛋白的表達，當LB培養(yǎng)基的pH降至5.5以下時，可溶性的α-葡萄糖苷酶的表達量顯著提高。極端pH可能會使細胞生長速率降低，從而防止細菌表達/加工系統(tǒng)過載。

在克隆基因的上游插入強的可調(diào)節(jié)啟動子和有效的核糖體結合位點，可以在細菌中表達非融合蛋白。融合蛋白能大量制備，易于純化，而且能賦予蛋白新的免疫學或生物學分析反應特性。

2.5 六聚組氨酸融合蛋白的純化

近年來，隨著蛋白質組學研究的發(fā)展，基因工程重組蛋白的分離純化技術顯得尤為重要，要將目標蛋白從復雜樣品中快速、特異地純化出來，就需要選擇合適的蛋白純化方法。

融合標簽技術是20世紀末興起的一種基于報告基因的重組DNA技術。融合標簽技術的發(fā)展使重組蛋白質的純化更加快速、簡便，并很快得到了應用。目前常用的蛋白純化標簽是GST（谷胱甘肽巰基轉移酶），6×His（六聚組氨酸）和表位標簽（如FLAG是專為蛋白純化和檢測設計的八肽，HA是流感病毒血凝素表位等），其中6×His最為常用，帶有6×His標簽的融合蛋白可利用固定化金屬鰲合親和層析和免疫親和法進行純化。

Porath于1975年首次提出固定化金屬螯合親和層析(IMAC)的概念[72]，該法基于蛋白質表面的組氨酸、半胱氨酸、色氨酸等殘基與固定化金屬離子的相互作用而對蛋白質進行分離純化。其中，組氨酸是與金屬離子作用較強的氨基酸，含有多個組氨酸的蛋白質可在IMAC中有效保留，故人為設計的多聚組氨酸便成為最常用的蛋白質純化標簽[73]。

免疫親和純化是一種利用抗原抗體特異性可逆結合特性的技術，它具有高效、高收率、濃縮效應等優(yōu)點。在眾多蛋白質純化技術中，免疫親和純化是十分關鍵的技術。標簽融合蛋白可通過抗標簽的單克隆抗體和多克隆抗體來純化。多數(shù)免疫親和純化都使用單克隆抗體，但有兩種類型的多克隆抗體可用于免疫親和純化，即針對合成肽(如6×His、FLAG標簽等)或某種抗原的特定區(qū)域產(chǎn)生的抗體。在這兩種情況下，由于結合到固定化抗體上的抗原位點局限在一個很小的區(qū)域，因此可實現(xiàn)有效的洗脫。目前已有商品化的特異性針對標簽的單克隆抗體，但價格都比較昂貴。

重組蛋白在大腸桿菌（E. coli）高效表達時，往往以不溶的、無活性的蛋白聚集體，即包涵體(inclusion body)的形式存在于細胞內(nèi)。必須從細胞內(nèi)分離出包涵體，采用高濃度變性劑（如7.0 mol/L鹽酸胍、8.0 mol/L脲）溶解包涵體，然后除去變性劑或降低變性劑的濃度，使包涵體蛋白得以復性，最后再用色譜法使目標蛋白質得到純化。其中包涵體蛋白的復性和純化是整個過程中的核心。

2.5.1 融合標簽技術

1）融合標簽技術

融合標簽技術是20世紀末興起的一種基于報告基因的重組DNA技術，其主要過程是利用重組DNA技術在靶蛋白編碼基因的3'端或5'端融合某種標簽的編碼基因，通過適宜的宿主來表達重組蛋白質[74-78]，表達的重組蛋白質可以通過融合的標簽與包被在固相基質上的特異配基結合而進行純化。融合標簽技術的發(fā)展使重組蛋白質的純化更加快速、簡便。近幾年，隨著新的融合標簽系統(tǒng)的開發(fā)，其功能逐漸多樣化，除用于蛋白質純化外，還用于蛋白質定位和檢測等。

2）融合標簽的種類

融合標簽根據(jù)其分子量大小可分為兩大類:大的蛋白質分子(或蛋白質結構域及其衍生物)和小的多肽片段。大的蛋白質標簽有GST(谷胱甘肽巰基轉移酶)、SPA(葡萄球菌蛋白A)和GFP(綠色熒光蛋白)等，它的使用會增加目標蛋白的溶解性，但在蛋白結晶和抗體產(chǎn)生等過程中，標簽必須去除。小的多肽標簽有6×His(六聚組氨酸)、HA(流感病毒血凝素表位)、c-myc(人c-myc蛋白表位)、FLAG(專為蛋白純化和檢測設計的八肽)等，多數(shù)情況下，由于多肽標簽相對較小，對融合蛋白質結構影響小，不需要從融合蛋白質中切除，因而多肽標簽較蛋白質標簽更為常用。迄今為止，己有文獻較為詳盡地報道了各種融合標簽[79，80]，其大小從幾個氨基酸到蛋白質不等，相互作用類型包括酶與底物、細菌受體與血清蛋白、六聚組氨酸與金屬離子、抗原與抗體等[81]。

3）融合標簽技術用于蛋白的純化

融合標簽技術用于重組蛋白質純化已為大量實驗所證實[82-86]。理論上，根據(jù)親和純化原理可定向設計使目標蛋白質與純化基質之間不發(fā)生任何直接相互作用的融合標簽，以避免由于這種直接相互作用造成蛋白質變性。目前已有許多不同的標簽可供利用。它們利用了標簽與固相配體間的相互作用，從而可從復雜的提取物中對標簽融合蛋白進行選擇性的結合和洗脫。目前常用的蛋白純化標簽是GST，His和表位標簽。

最常用的標簽是His標簽，即多聚組氨酸。該標簽由6～10個連續(xù)組氨酸組成，置于蛋白的氨基或羧基末端。His標簽與其他標簽相比有很多明顯優(yōu)勢：①對金屬離子如鎳、鈷有高度的選擇性和親和力[87]；②與金屬離子的結合不受變性劑(尿素、胍)的影響；③溫和多樣的洗脫條件(100～250 mmol/L咪唑，低pH，10 mmol/L EDTA)。目前已有各種商品化介質(Ni-NTA-Agarose，Ni-IDA-Agarose)提供。另外，抗His標簽的單抗或多抗也被應用于His融合蛋白的純化。

GST標簽是用來從細菌表達系統(tǒng)中純化蛋白較為成功的標簽之一。在該系統(tǒng)中，GST與被標記的蛋白進行融合，融合后的蛋白可在許多表達系統(tǒng)中表達。GST和谷胱甘肽緊密結合，融合蛋白可通過谷胱甘肽固相柱純化，洗脫未結合的蛋白后，結合蛋白可用含游離的谷胱甘肽緩沖液進行洗脫。該系統(tǒng)中被融合的目標蛋白?？烧_的折疊成為有功能的區(qū)域，故十分有用。該系統(tǒng)的另一個優(yōu)勢是可快速、溫和地純化，且配體谷胱甘肽的成本較低。

表位標簽(HA、c－myc和FLAG等)也已廣泛用于融合蛋白的純化研究。目前已有商品化針對表位標簽的單克隆抗體。為使標簽在純化中發(fā)揮良好的作用，在純化過程中應盡量避免使用劇烈的條件使抗體和標簽之間解離，劇烈的條件可使抗原發(fā)生不可逆變性，目標蛋白的回收率低。用游離多肽競爭洗脫法洗脫結合在固相抗體上的標簽融合蛋白，是優(yōu)選的方法。

4）融合標簽技術在其他領域的應用

融合標簽可提高重組蛋白的產(chǎn)量，由于外源蛋白質對于宿主菌的異質性，當外源蛋白質在宿主菌內(nèi)表達時，宿主菌會調(diào)動各種機制來阻止外源蛋白質過量表達，導致的直接后果就是我們所需要的目標蛋白質表達量降低。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，當外源蛋白質融合某些特定的標簽后，能夠有效增加重組蛋白質的產(chǎn)量[88-90]。

融合標簽還可增強重組蛋白質的可溶性，外源蛋白質在宿主菌內(nèi)表達時大多以包涵體形式存在[91]，致使很難獲得大量有活性的天然蛋白質。為了防止包涵體形成，一般可以采用低溫誘導表達蛋白質，但這種方法并非對所有蛋白質都有效。研究發(fā)現(xiàn)，一些高度可溶的蛋白質在與其他蛋白質融合后會促進融合蛋白質以可溶形式表達，如MBP等[92，93]。

2.5.2 金屬螯合親和層析技術

1）金屬螯合親和層析技術的發(fā)展

1948年，Hearon發(fā)現(xiàn)水溶液中組氨酸和半胱氨酸可與Cu2+，Zn2+形成穩(wěn)定的復合物。研究還發(fā)現(xiàn)，固定在凝膠上的金屬離子Cu2+或Zn2+可與蛋白質表面裸露有咪唑基或巰基的氨基酸殘基結合。因此，含有金屬離子Cu2+或Zn2+的凝膠可用來選擇性吸附表面含有組氨酸或半胱氨酸的多肽或蛋白質。

1961年，Hellferich提出以固定于載體的金屬離子來分離小分子的概念，稱為配基交換層析(ligand exchange chromatography，LEC)[94，95]。

1975年，Poroth首次提出“固定化金屬螯合親和層析(Immobilized Metal-Chelated Affinity Chromatography，IMAC)”的概念[72]，首次成功地在瓊脂糖凝膠上偶聯(lián)了螯合配基亞氨基二乙酸(IDA)。IDA與金屬離子如Cu2+螯合后，可與蛋白質結合，不同組成的蛋白質與金屬離子結合力不同，據(jù)此將蛋白質進行分離。最常用的金屬離子包括Cu2+，Ni2+，Zn2+和Co2+等過渡態(tài)金屬離子。不同蛋白質分子內(nèi)的組氨酸、半胱氨酸以及色氨酸等殘基種類、數(shù)量、位置和空間構象不同，因而與金屬配基的親和力大小不同，從而可選擇性地加以分離純化。

1987年，Hochuli等[96]在目標蛋白質末端接上六聚組氨酸多肽得到純化的重組蛋白質。此后六個組氨酸標簽廣泛應用于重組蛋白質的純化。近年來，原核生物表達的重組蛋白質已有50%以上都是通過末端接有六聚組氨酸多肽而被純化出來[97]。

目前，固定化金屬螯合親和層析技術已成為蛋白質，特別是基因重組蛋白和多肽分離純化最有效的工具之一。

2）金屬螯合親和層析作用原理

固定化金屬螯合親和層析基于蛋白質表面氨基酸與固定化金屬離子的親和力不同對蛋白質進行分離。金屬螯合親和介質與蛋白質的作用如圖2.1所示。過渡態(tài)金屬離子能與電子供體氮、硫、氧等原子以配位鍵結合，金屬離子上剩余的空軌道是電子供體的配位點，在溶液中被水分子或陰離子占據(jù)。當?shù)鞍踪|表面氨基酸殘基與金屬離子的結合力較強時，氨基酸殘基的供電原子(如組氨酸殘基的N原子、半胱氨酸殘基的S原子)將取代與金屬離子結合的水分子或陰離子，與金屬離子形成復合物，從而使蛋白質分子結合在固相介質表面。氨基酸中的α-氨基和α-羧基，以及某些氨基酸側鏈基團含有孤對電子的活性原子都能參與螯合反應，由于蛋白質表面這些氨基酸的種類、數(shù)量、位置和空間構象不同，因而與金屬配基的親和力大小不同，從而可選擇性地加以分離純化[98]。

圖2.1 金屬螯合親和介質與蛋白質的作用

生物分子與金屬離子間的結合強度與它們的軌道重疊程度有關，結合作用可分為三種[99-100]：

（1）靜電吸引：修飾后的基質帶有凈負電荷，它可吸附分離表面氨基酸殘基帶正電荷的蛋白質。

（2）配位鍵結合：蛋白質表面的組氨酸、色氨酸、半胱氨酸等殘基上有咪唑基、吲哚基、巰基等，其氮原子、硫原子上未共用電子對與固定化金屬離子形成配位鍵。

（3）共價鍵結合：固定化金屬離子與蛋白質表面含硫基團作用形成共價鍵。

蛋白質與金屬離子親和力不同可用Pearson的軟硬酸堿理論來解釋[101]。該理論認為兩個原子相互作用成鍵時，其中一個原子作為路易斯酸，另一個作為路易斯堿。根據(jù)軟硬酸堿理論，金屬離子如K+、Ca2+、Mg2+、Fe3+屬于硬酸；單價金屬離子如Ag+、Cu+歸類為軟酸；過渡態(tài)金屬離子如Cu2+、Co2+、Ni2+、Zn2+屬于中間酸。相應的，與金屬離子結合的配基如氨基酸或蛋白質可分為三類堿，其中含氧原子(如羧基)、脂肪族的氮原子(如天冬氨酸和谷氨酸)和磷原子(如磷酸化的氨基酸)的配基屬于硬堿；含硫原子(如半胱氨酸)的配基屬于軟堿；含芳香族氮原子(如組氨酸、色氨酸)的配基屬于中間堿。中間酸Cu2+、Co2+、Ni2+、Zn2+可與含芳香族氮原子(如組氨酸、色氨酸)的中間堿以及半胱氨酸結合。由于蛋白質表面裸露氨基酸中半胱氨酸極少，因此組氨酸殘基是與過渡態(tài)金屬離子結合的主要基團[102]。

六聚組氨酸融合蛋白在金屬螯合親和層析介質表面結合和解離流程如下：

（1）將螯合配基以共價結合的方式固定在固相載體上。

（2）加入含有金屬離子如Co2+、Ni2+的溶液，金屬離子會與螯合配基形成配位鍵而固定在固相載體上。

（3）加入含有六聚組氨酸融合蛋白的溶液或發(fā)酵液，使六聚組氨酸融合蛋白與金屬離子間以配位鍵方式結合在固相載體上，而與金屬離子沒有作用力的蛋白被分離出去。

（4）洗脫結合在固相載體上的六聚組氨酸融合蛋白。對金屬螯合親和層析介質上所結合的六聚組氨酸融合蛋白常用pH值(pH 4～5)或含咪唑的溶液進行洗脫，低pH可減弱蛋白和金屬離子的相互作用，使六聚組氨酸融合蛋白得以洗脫，而咪唑是競爭性取代劑，可置換結合在介質上的六聚組氨酸融合蛋白，較低的pH和咪唑互相配合可更好地使六聚組氨酸融合蛋白被洗脫[103]。

3）金屬離子的選擇

金屬離子的配位數(shù)直接影響其與螯合配基及生物分子的結合，配位數(shù)既要保證能與螯合配基形成穩(wěn)定的化合物，又要保證有剩余的位點與目標蛋白的氨基酸殘基結合。由于金屬離子所帶電荷、離子半徑等不同，對蛋白質呈現(xiàn)不同親和力，目前常用金屬離子有Cu2+、Co2+、Ni2+、Zn2+等，它們具有相同電荷，離子半徑分別為69、72、74和74pm。半徑越小，配位作用越強，與蛋白質形成的絡合物越穩(wěn)定。因此，Cu2+對蛋白質結合力最強，Ni2+次之，Co2+和Zn2+結合相對較弱[104]。

4）金屬螯合親和層析用于生物分離純化

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[中圖分類號]R714.21 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）04（c）-0101-04

[Abstract] Objective To investigate the relationship between the dynamic changes of β-HCG， P， sHLA-G and pregnancy outcome. Methods Patients with threatened abortion and tocolytic treatment in Changsha Maternal and Child Health Care Hospital （"our hospital" for short） from July to December 2015 were selected as experimental objects. During the course of treatment， 34 cases of spontaneous abortion were set as abortion group， and 106 cases of pregnancy were set as pregnancy group. At the same time， 50 cases of pregnancy women for regular routine inspection in our hospital were selected as control group. Serum sHLA-G changes were measured quantitatively by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） at 5 to 10 weeks of gestation. Serum β-HCG and P Levels were detected by chemiluminescence method. Results Serum sHLA-G levels of pregnant women from 5 to 10 weeks among three groups were compared， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Serum sHLA-G levels of pregnant women from 5 to 10 weeks in abortion group and pregnancy group were compared， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Serum β-HCG levels of pregnant women from 5 to 10 weeks among three groups were compared， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Serum β-HCG levels of pregnant women at 7， 8， 10 weeks between control group and pregnant group were compared， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Serum β-HCG levels of pregnant women from 7 to 10 weeks between abortion group and pregnant group were compared， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Serum P levels of pregnant women from 5 to 10 weeks among three groups were compared， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Serum P levels of pregnant women from 7 to 8 weeks between control group and pregnant group were compared， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Serum P levels of pregnant women from 7 to 10 weeks between abortion group and pregnant group were compared， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion sHLA-G combined with β-HCG and progesterone as the preadictors of threatened abortion outcome can improve the accuracy of prediction and reduce unnecessary treatment， it is spefic for sHLA-G to distinguish the pregnancy outcome of threatened abortion in early pregnancy of 5， 6 weeks.

[Key words] Threatened abortion； sHLA-G； Outcome prediction

先兆流產(chǎn)是孕期常見的臨床病癥之一，占全部妊娠的10%～15%[1]。妊娠早期通過檢測相關因子來預測其發(fā)展為不良妊娠的風險，可減少不必要的保胎治療，減輕患者心理負擔。大量研究顯示，先兆流產(chǎn)患者體內(nèi)β血清人絨毛膜促性腺激素（β-HCG）、孕激素（P）、血清可溶性人類白細胞抗原G（sHLA-G）水平會發(fā)生變化[2-4]，本文通過聯(lián)合動態(tài)檢測β-HCG、P、sHLA-G變化來研究其對先兆流產(chǎn)結局的預測價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年7～12月就診于長沙市婦幼保健院（以下簡稱“我院”）并要求保胎的先兆流產(chǎn)患者140例，年齡20～35歲，平均年齡（24±5）歲，孕齡5～8周，平均（6.56±1.60）周。治療過程中自然流產(chǎn)者34例設為流產(chǎn)組；繼續(xù)妊娠者106例為妊娠組；選擇同期在我院定期常規(guī)產(chǎn)檢的50例正常妊娠孕婦為對照組，年齡20～35歲，平均（23±4）歲，孕齡5～12周，平均（6.83±1.50）周。三組孕婦的一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），具有可比性。孕齡的確定依照孕婦的末次月經(jīng)及經(jīng)陰道超聲測胎兒頭臀長度計算。

1.2 納入標準

①病史：停經(jīng)5～12周。②癥狀：血性白帶甚至陰道流血，數(shù)小時至數(shù)天后有或無下腹脹痛、腰骶部墜痛、酸脹等不適。③婦科體征：宮頸口閉合、未見妊娠物排出，子宮大小與孕婦停經(jīng)周數(shù)相符合。④輔助檢查：B超示子宮內(nèi)見孕囊，有或無胚胎存及心臟搏動；尿妊娠試驗陽性。

1.3 排除標準

①雙胎；②保胎治愈組患者孕12周內(nèi)再次出現(xiàn)先兆流產(chǎn)癥狀或住院期間孕齡6～10周血sHLA-G、P、β-HCG值未連續(xù)監(jiān)測者；③入院后未經(jīng)治療即明確診斷為不良妊娠者；④排除夫妻雙方染色體異常、孕婦糖尿病等慢性疾病及免疫性、解剖及感染性因素。

1.4 研究方法

1.4.1 儀器及方法 治療前及治療期間每4天分別抽取兩管靜脈血，每管4 mL，4000 r/min離心，留置血清，一管置于2～8℃冰箱中保存，采用化學發(fā)光法檢測β-HCG及孕酮水平，另一管置于-80℃冰箱中儲存至檢測，采用雙抗體夾心法檢測sHLA-G，試劑盒來自上海史瑞可生物有限公司；采用酶標儀（美國550型BIO-RAD）測定吸光度，波長為450 nm，所測為血清總sHLA-G水平。

1.4.2 治療方案 HCG 2000 IU肌內(nèi)注射，一日兩次，黃體酮20 mg肌內(nèi)注射，一日一次，至陰道流血停止3 d后為止。治療期間B超確診為胚胎停育或流產(chǎn)者終止保胎治療。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析和處理，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，多樣本均數(shù)比較采用方差分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組孕婦不同孕齡時間血清sHLA-G水平比較

三組孕婦孕5～10周血清sHLA-G水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；對照組與妊娠組孕5～10周血清sHLA-G水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）；流產(chǎn)組與妊娠組孕5～10周血清sHLA-G水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；三組孕婦血清sHLA-G的95%參考值范圍不同，且不存在交叉范圍。見表1。

2.2 三組孕婦不同孕g時間血清β-HCG水平比較

三組孕婦孕5～10周血清β-HCG水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；對照組與妊娠組孕7、8、10周血清β-HCG水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；流產(chǎn)組與妊娠組孕7～10周血β-HCG水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表2。

2.3 三組孕婦不同孕齡時間血清孕酮水平比較

三組孕婦孕5～10周血清孕酮水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；對照組與妊娠組孕7～8周血清孕酮水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；流產(chǎn)組與妊娠組孕7～10周血清孕酮水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表3。

篇5

對此，荷寶基金首席分析師陸敏在接受《中國聯(lián)合商報》記者采訪時分析：“這意味著上海白貓股份，已經(jīng)站在了生與死的十字路口。他們目前只有或者重組成功或者暫停上市甚至退市兩種選擇。”

難解的虧損困惑

根據(jù)上海白貓股份年報披露的數(shù)據(jù)，上海白貓股份2008年實現(xiàn)主營業(yè)務收入34895.31萬元，同比略升1.18％；受外部環(huán)境影響，實現(xiàn)主營業(yè)務利潤2709.51萬元，同比下降28.31%?？鄢N售費用近5000萬元、管理費用3400多萬元、財務費用300多萬元等，白貓的凈利潤為-3500多萬元，每股收益為-0.234元。

“大家都在把虧損歸咎于去年爆發(fā)的金融危機，可我們在國際貿(mào)易上是贏利的，不知問題到底出在哪了。”上海白貓股份國際貿(mào)易部一負責人，在接受《中國聯(lián)合商報》記者采訪時說道。

對此，上海白貓股份董事長辦公室一負責人陸梅向《中國聯(lián)合商報》記者進行了解釋：“我們在去年的外貿(mào)銷售收入同比上升了24.78％，但受人民幣匯率上升的影響，銷售利潤卻同比減少1224.21萬元；再加上前年下半年國家開始調(diào)整牙膏出口退稅率，也使我們外貿(mào)銷售利潤同比減少539.97萬元。”

“這些都是大家共同面臨的外部大環(huán)境，白貓股份之所以連年出現(xiàn)虧損。我認為最重要的是在國內(nèi)牙膏產(chǎn)品銷售異常激烈的情況下，白貓股份由于重組不暢導致投入不足，以致影響了它的市場營銷和拓展進度。”中投證券上海營業(yè)部投資經(jīng)理戴克江向《中國聯(lián)合商報》記者如此表示。

一波三折的重組

對于上海白貓股份的處境。業(yè)內(nèi)人士分析，必須依靠大股東的力量才能走出來。但在事關重組的大問題上，上海白貓股份的大股東浙江新洲集團的表現(xiàn)讓人很是摸不透。“我們的管理層也一直在積極配合、督促大股東推進資產(chǎn)重組工作，可自從去年4月28日出臺了一個重組方案后就一直進展不順。現(xiàn)在更是沒有任何動靜和進展?！标懨穾c抱怨的口氣向《中國聯(lián)合商報》記者說。

根據(jù)陸梅的說法，在2008年4月28日和5月9日，他們曾聯(lián)合第一大股東新洲集團對上海白貓股份做了一個重大資產(chǎn)重組的公告。公告的大體內(nèi)容是新洲集團將下屬房地產(chǎn)公司股權與白貓股份的全部資產(chǎn)、負債進行置換，置換完成后，白貓股份轉型為房地產(chǎn)開發(fā)企業(yè)。

而在《中國聯(lián)合商報》記者致電新洲集團總裁辦公室詢問時。一個姓王的負責人也表示：“現(xiàn)在還沒有任何關于重組這方面的新消息。具體的部署也還沒聽說?！辈贿^談起這個重組方案姓王的負責人承認有這個事?！盀榱舜舜钨Y產(chǎn)置換，我們還在上海普陀區(qū)全資設立了上海威順投資管理有限公司，用于購買新洲集團擁有上海白貓股份的股權，再將白貓股份全部資產(chǎn)和負債劃進來?！?/p>

新洲集團在當時也承諾，“在注入兩家地產(chǎn)公司進入白貓股份后，新洲集團將不再從事新的房地產(chǎn)業(yè)務以解決同業(yè)競爭的問題。”

沒有選擇的選擇

那么面對連年虧損和重組的緩慢，上海白貓股份到底是選擇重組成功還是暫停上市甚至退市，恐怕已經(jīng)沒有多少時間來進行思考了。

“上海白貓股份是國企，在日用領域尤其是牙膏方面是中國的一面旗幟。因此是不可能輕易退市的。剩下的就只有一條路可選了那就是重組。”陸敏向《中國聯(lián)合商報》記者解釋。

事實上，這幾年上海白貓股份也一直為避免退市而掙扎著。如在2005年白貓股份在凈利潤為-701萬元的情況下，才引入了新洲集團。

對此說法，王立欣表示認同?！爱斎蝗绻軌蚺ぬ潪橛昧?。但截止上海白貓股份到今天的表現(xiàn)，這種可能性的發(fā)生有很大的難度?！?/p>

相關資料也顯示，此前的2007年，白貓股份虧損了925.2萬元。而今年則是3500萬元。顯然，白貓股份的經(jīng)營情況非但沒有好轉，而且呈現(xiàn)出加速滑向泥潭的趨勢。然而，白貓股份的資產(chǎn)置換方案至今尚無明顯的進展。

“我認為不排除改變把上海白貓股份變?yōu)榉康禺a(chǎn)公司的重組計劃，畢竟作為上海白貓的第一大股東，新洲集團此前一直沒有過經(jīng)營日化行業(yè)的背景，而且從新洲集團進入上海白貓股份的作為看，也并沒止住上海白貓股份繼續(xù)下滑的勢頭?！贝骺私颉吨袊?lián)合商報》記者分析。

篇6

比如李嘉誠在內(nèi)地保健品領域，就擁有不小的話語權。

羊胎素、有機奶粉、專供孕婦食用的 DHA產(chǎn)品，以及某些內(nèi)地學生逢大考前常常吃的保健品，都有李嘉誠的產(chǎn)業(yè)。準確地說，這些產(chǎn)業(yè)都歸攏在和記黃埔旗下的和黃健寶保健品有限公司，這家公司成立已超過10年。

求醫(yī)問藥時，有些常用藥，比如板藍根顆粒、復方丹參片，也有李嘉誠的影子。

和記黃埔旗下有專門的醫(yī)藥科技公司，在醫(yī)藥行業(yè)是不折不扣的“隱形大戶”，勢力覆蓋“北上廣”李嘉誠在北京與同仁堂合作，在上海開辦有上海和黃醫(yī)藥有限公司，在廣州與白云山醫(yī)藥合資建廠。

2004年時，李嘉誠明確定調(diào)：中藥將是和記黃埔的第六大支柱產(chǎn)業(yè)。緊跟著在2006年，李嘉誠就將他的醫(yī)藥公司名單，掛上了歐洲的倫敦交易所，成了筆跨國大生意。 2011年5月20日，香港，李嘉誠在公司股東會后出席新聞會。

另外一個巨頭雀巢公司就看中了李嘉誠在中藥產(chǎn)業(yè)上的判斷，更看中李嘉誠在中藥行業(yè)隱秘深耕多年的家底：和記黃埔的中藥材庫十分巨大，包括1200多種藥用植物的5萬種提取物。去年年底，雀巢第一次涉足中藥產(chǎn)業(yè)在此之前，這家瑞士公司也確實在嘗試做一些實驗，比如在嬰兒米粉中加入綠豆和蓮子，讓產(chǎn)品能“去火”。

雀巢現(xiàn)在與李嘉誠合伙開辦了一家公司，希望可以找到用中藥治療腸胃病的辦法。

總之，熱衷于進入醫(yī)藥行業(yè)，這一點李嘉誠與比爾·蓋茨的投資興趣很像。

除此之外，一個日化品牌白貓洗潔精，從2006年開始，就已經(jīng)是李嘉誠的無形資產(chǎn)。2006年和記黃埔收購了白貓集團所持有的上海白貓有限公司80%的股份，共同組建上海和黃白貓有限公司，也就是“和黃白貓”。2009年4月，白貓集團又將“白貓”商標轉給和黃白貓，所以在市場上看到的“白貓”洗滌產(chǎn)品，已經(jīng)蓋上了李嘉誠的烙印。

需要說明的是，“白貓”其實有兩個，另一個“白貓”是白貓股份，是一家經(jīng)營不善的上市公司，2010年已退市。其間兩只“白貓”烏龍不斷，引得和記黃埔的新聞發(fā)言人要不時澄清：這只白貓和李嘉誠沒關系。

李嘉誠在另一個時髦領域互聯(lián)網(wǎng)、IT行業(yè)的投資令人感覺距離感更小。

他投過facebook、skype，以及后來被蘋果公司買走的語音助手軟件Siri。投facebook的決策時間只花了五分鐘，而當時的facebook尚未營收。五年間，他手中所持的3%股權，回報率高達580%，據(jù)估計，他能從中賺得20多億美元。李嘉誠卻表示，在自己投資的新科技公司中，facebook賺得未必最多。

為他物色高科技企業(yè)的公司叫維港投資，專注于中早期科技類項目其操盤者正是五分鐘內(nèi)說服李投facebook的周凱旋。據(jù)《經(jīng)濟觀察報》報道，維港投資團隊成員只有四名，一貫低調(diào)，沒有官方網(wǎng)站，卻能憑其遍布全球的團隊，挖掘出一般人不易察覺的項目。

再往近了說，我們的“衣食住行”，也有“李嘉誠牌?！比A南地區(qū)能吃到的東北大米，會有一部分來自和記黃埔在黑龍江的生產(chǎn)基地?！蹲C券時報》曾經(jīng)報道說，在中國入世前，李嘉誠受邀到黑龍江投資稻米，并于1998年成立合資企業(yè)，開發(fā)近150萬平方公里產(chǎn)糧地。

篇7

1998年，埃米爾·庫斯圖里卡導演的作品《黑貓白貓》一經(jīng)推出便備受矚目。似乎總是不修邊幅的人物形象，粗糲而又充滿想象力的畫面，濃烈的影像色彩，鋪天蓋地的戲謔、玩笑、嘲弄和尋歡作樂，毫不吝嗇的語言對白，此起彼伏的喧鬧場景，喜劇化的故事結局——在這些庫氏影片的慣?！鞍d狂笑鬧”影像風格背后，也隱藏著庫斯圖里卡慣常的某些觀念和情愫。而對該片不同年齡層人群的劃分和形象設定的解讀分析，正是我們深入探尋導演觀念和情愫的最佳途徑。

一

《黑貓白貓》片中的人群，可以按照年齡層劃分為三個明顯的人群——老人、孩子和中年人。每一個年齡層人群，總有著對應的人物性格和形象。

電影中的兩個老頭子：吉普賽黑幫教父格加和他的老友扎吉，還有個吉普賽大媽，性格是如此地相像——和藹開明、關愛孫輩、而又有些孩子氣的老頑童。

格加最喜歡重復觀看《卡薩布蘭卡》的結局部分，并重復那句經(jīng)典的臺詞“路易，我想這是一段美好友誼的開始”。在影片最后，看著扎吉的孫子扎拉和愛人艾達在多瑙河上完成婚禮并登上游船后，他和扎拉一邊干杯一邊再次念出這句臺詞——和閣樓上這兩位老友被“死后”冰封又同時“復活”的奇妙經(jīng)歷結合起來，這句經(jīng)典臺詞和他們手中的美酒，真正成為兩人幾十年友誼的最佳象征。

在家庭內(nèi)部，這三位老人最為關心的就是自己的孫輩。格加一次又一次勸說長孫葛爾加結婚。扎吉為了孫子特意把所有積蓄都藏在手風琴里并最終念念不忘地親手交給了他，甚至愿意以自我犧牲來阻止孫子將要被迫進行的不幸婚禮。艾達的吉普賽祖母從一開始想把孫女艾達賣給黑幫頭子達旦做老婆，到后來接受了孫女對愛情的選擇。三位老人對于家庭后代的關愛，與后面將要提到的中年人一代形成了諷刺性的鮮明對比。

影片中的幾個孩子——扎拉、艾達、葛爾加以及達旦的妹妹“小瓢蟲”，都是執(zhí)拗而可愛的，都有著對愛情的堅持。他們身上所展現(xiàn)的正是青春的張揚和對愛情的忠貞。經(jīng)過掙扎、反抗與堅持，扎拉和艾達、葛爾加和“小瓢蟲”這兩對有情人終成眷屬，這是庫斯圖里卡對于這種青春的真善美的肯定和贊美。

反觀影片中的中年人一代，其代表就是財迷心竅、膽小懦弱的馬考以及其暴戾蠻橫、欺軟怕硬的“好友”——自稱“商人和愛國者”的黑幫匪徒頭子達旦，以及那個道貌岸然的政府證婚官員。

馬考一直覬覦父親的工廠和財產(chǎn)，并且妄想通過侵吞國家物資來大發(fā)不義之財；而流氓成性的達旦則對“好友”馬考的發(fā)財計劃來了個殺人吞贓，甚至對馬考一頓毒打。為了金錢利益，他們合計著分別出賣了自己的兒子和妹妹的婚姻幸福。由于格加和扎吉兩位長輩先后突然“猝死”會打斷婚禮，兩人不顧一切地將兩位老人的“尸身”冰凍起來--從這對中年“老友”身上，觀眾只能看到荒誕不經(jīng)、財迷心竅、爾虞我詐以及對家庭成員的漠視和利用。和他們長輩的交情相比，他們之間的“友情”是何其的荒誕與諷刺。

而那位西裝革履的證婚官員，他摔開的皮箱里除了文件外還赫然滾落出各種吸毒工具——癮君子的事實將他冠冕堂皇的臉皮在眾人面前瞬間揭穿。而為了保住顏面，他居然還向同為癮君子的達旦結結巴巴地辯解和哀求。這種戲劇化效果帶來的諷刺真可謂酣暢淋漓。

二

通過對人物群體的劃分，片中老人、孩子和中年人這三組人群迥異的形象得以分別展現(xiàn)。而導演如此劃分人群并設定群體形象的動機，就需要進一步解讀了。

從庫斯圖里卡的電影作品特征來看，狂歡、家庭、鄉(xiāng)愁、音樂、黑色幽默和政治諷喻這幾大元素可謂旗幟鮮明。尤其是政治諷喻這一重要元素，在其青年時代的電影創(chuàng)作中就已初現(xiàn)端倪。而在他被迫遠離南斯拉夫長期旅居西歐的二十世紀九十年代期間，南斯拉夫已經(jīng)處在戰(zhàn)亂頻繁、分崩離析的階段。庫斯圖里卡電影作品中的鄉(xiāng)愁和政治諷喻元素，在無形中產(chǎn)生融合并顯得更為濃重。如果說1995年推出的《地下》淋漓盡致地展現(xiàn)了這種融合的話，那么《黑貓白貓》則是在另外一種視角的小范圍故事框架內(nèi)，含蓄地將這種融合潛藏了起來。這些因素便是對本片群體形象進行解讀的關鍵癥結所在。

從二戰(zhàn)爆發(fā)到整個冷戰(zhàn)時期的幾十年時間里，無論是面對納粹德國還是蘇聯(lián)，南斯拉夫一直是一個敢于抗爭、從不屈服的國家。而《黑貓白貓》中所塑造的年輕人群體形象，同樣是勇于堅持、敢于抗爭的，這可以視作是南斯拉夫幾十年來國家不屈形象的人形化表現(xiàn)。通過對影片中年輕人們最終爭取到自由和幸福命運的歌頌與贊美，庫斯圖里卡也完成了對故國南斯拉夫的致敬。

對于影片中的老人群體，庫斯圖里卡對他們也持著一種肯定和贊美的態(tài)度。他們對孫輩的關愛和付出、甚至是自我犧牲，其實也象征著真正的愛國者對于南斯拉夫這個國家的真正關愛--不僅是關心孩子和國家的現(xiàn)在，也關心孩子和國家的未來。作為一個電影藝術家，庫斯圖里卡多少也把自己對故國南斯拉夫的熱愛之情，通過片中老人們這個群體加以抒發(fā)。

相對的，影片中的中年人形象也是庫斯圖里卡用意最深的部分——這些財迷心竅、好賭濫飲、道貌岸然的投機犯、癮君子和偽君子們，他們本應是家庭的主心骨、國家的中堅力量。但是在影片中，他們的形象卻是如此不堪入目?？梢哉f，庫斯圖里卡所塑造的這些中年人的形象，正反映了他對于搞垮南斯拉夫的那批蛀蟲的痛恨和不齒。如此塑造這兩個中年人的形象，就是對造成南斯拉夫動亂分裂的那些罪魁禍首的一種諷喻。

同時我們也可以發(fā)現(xiàn)，影片中的老人群體對這些中年人群體往往持有一種懷疑甚至是厭惡的態(tài)度——扎吉更喜歡懂事的孫子扎加而不是兒子馬考，格加并不待見上門借錢的馬考并拔槍警告他，格加面對達旦時的那種輕蔑態(tài)度……可以說導演借助片中老人群體對中年人群體態(tài)度的設定，抒發(fā)著自身對于片中中年人群體所象征的現(xiàn)實人群的憎惡情感。

篇8

話劇開始了，出現(xiàn)了獨眼狼、單眼狼，他們被關進大牢里，外面有很多士兵守衛(wèi)。就在這個時候，臭狐貍代表大灰狼來看他們。它手里拿著一盒曲奇餅干，說：“我特意代表大灰狼來看你們了，這盒餅干是我們的一點心意。當年大灰狼和你們一起坐牢，可是被一場海嘯分開了，這次我們找到了你們，特意送來餅干，表示一點心意……”

狐貍走了，衛(wèi)兵也走了。獨眼狼和單眼狼食偷偷地把曲奇餅干盒打開，他們發(fā)現(xiàn)盒子里面有一個紙條和一把萬能鑰匙，他們說：“這一定是大狼給我們的。”然后他們說，這兩天一定會來一場大大的雷陣雨，所以要它們趁雷陣雨和霧氣很大時把門偷偷打開，逃出去。

當然，這個計劃成功了。半路上，突然聽到黑貓警長的聲音，他們拼命的逃，逃到了一家超市店門口，因為今天有雷雨，超市提前關門。他們突然想起自己手中有一把萬能鑰匙，他們就用萬能鑰匙把門打開，進入超市偷走了很多東西，把肚子也填飽飽的了。

可當出來的時候，發(fā)現(xiàn)黑貓警長把他們包圍了。這時，大狼和狐貍從四周殺來救他們，于時他們沖出了包圍。壞蛋們一起逃啊逃啊，突然發(fā)現(xiàn)黑貓警長在前面攔住了他們，白貓警長和小鹿警官在后面攔住了他們，使他們無路可逃，又被關進了大牢。

篇9

這三節(jié)課的共同點是：

一、基本上都落實了學講計劃的精神，先學后教，給足了學生自主學習的時間，整個教學過程中滲透了學生的自學、互學，教學的痕跡。突出了學生的主體地位，教師退到了后面，給足了學生充分展示自己的機會，教師主要發(fā)揮四兩撥千斤的作用。

二、課堂教學有重點突出，教師對于教材的解讀深刻，有新意，教學程序設計巧妙，環(huán)環(huán)相扣，條理清晰。教學過程中，重視對學生的朗讀訓練，形式多樣，教師指導到位。

三、教師教態(tài)自然大方，在上課前都注重課堂管理，采用交談，夸贊、鼓勵性的話語拉近與學生的距離，讓學生入情入境，充分調(diào)動學生的學習積極性，課堂氣氛活躍。在教學過程中，教師語言親切柔和，對學生的表現(xiàn)，評價及時中肯。

這三節(jié)課體現(xiàn)了三種不同的風格：

第一節(jié)宋穎老師執(zhí)教的《桂花雨》，就如宋老師給人的春風化雨般的感覺一樣，溫柔舒適，親切柔和，真有如沐春風般的感覺。尤其是指導朗讀很有特色，善于創(chuàng)設情景讓學生入情入境。在指導朗讀贊美桂花之香時，創(chuàng)設了四種情景讓學生讀，當桂花落在額頭、鼻尖、衣袖、全身不同的情況下對桂花的贊美。再如理解"纏"時，又創(chuàng)設了一天之內(nèi)的不同時間"纏"著媽媽問啥時搖桂花的情景，讓學生朗讀體會。最動情的地方是配樂朗讀和電影般的情景再現(xiàn)似回讀。宋老師選的配樂曲溫婉動聽，聽了確實令人動情，加之宋老師高超的朗誦水平，確實讓學生直接的感受到了懷念故鄉(xiāng)之情。宋老師還聯(lián)系了最后一句中懷念兒時搖桂花的情景，運用配樂的方式回讀文章的第三節(jié)搖桂花的句子，再現(xiàn)了這一情景，真如電影回放一樣，聽這節(jié)課令人很感動。

篇10

希望變成失望

山里到處是冰冷的空氣。但清晨的陽光總能給人帶來一絲的希望?？墒俏覜]有想到以后的路是這樣艱難。 　今天的目標是碎石達板，不知為什么在大家的印象中翻過碎石達板就象征著即將到來的成功，剩余的路好象不再是路。

雪隨著行進的腳步慢慢的越過腳腕，河道的冰層在太陽的照射下閃閃發(fā)光，一個渾然的天然冰場!我們感嘆著。

董隊、徐姐、王志和我選擇了走山脊的路，大笨笨、飛磚、30、大臣、探路魚、長白貓則選擇了河谷，我們兩隊人馬遙遙相應的在寒風中行進。

河谷中依稀地出現(xiàn)了點點的帳篷，心理開始納悶這前面的也走的太快了，我們準備探個虛實。還未下到一半就見一人揮舞著雙仗，原來是飛磚大聲高喊，隱約中只聽到博格達有暴風雪的字樣，我的心剎時跌入了低谷之中，大家都知道暴風雪將意味著什么。

原來在此扎營的是另一隊人馬，昨晚已到這里，領隊用很有經(jīng)驗的樣子告訴我們博格達此刻正在暴風雪中，如果能上他們一大早就上了，這可是在拿生命開玩笑。 　當說到生命二字的時候大家的表情都很嚴肅，當面臨選擇的時候又該如何取舍。就在大家迷茫地作著思想斗爭的時刻，董隊堅決地說繼續(xù)前進能不能上我們也得走到三號羊圈看了天氣情況再定，就這樣一句簡短而堅決的話語重新堅定了大家已經(jīng)快被瓦解了的信心。由于“大臣”早晨貪吃了“飛磚”的兩個雞蛋，膽囊炎發(fā)作只好跟隨另隊人馬返回之外，其余的9人又踏上了新的征途。

前方的路越發(fā)模糊，風夾雜著地上的浮雪吹著大家紅撲撲的小臉和大臉，可是沒有一個人退縮，頂風而上迎來的是迷霧中的碎石達坂……

去不去大本營

小冰湖的雪比想象中的更深，惡劣的天氣迫使我們不得不在小冰湖扎營。 　兩個小時過去了，可是我們還未走出小冰湖，道路的艱難再一次出乎每個人的意料。是否去大本營成為大家爭論的焦點。這個時候董隊堅持，到了以肯奇達坂的腳下再做決定。夏天從這里往返大本營一小時的路程現(xiàn)在預計需要3小時。隊伍慢慢的向前推移，行進的速度怎么都無法提起，12點我們才走到達坂腳下，這時候雪已經(jīng)漫過膝蓋，腳下的石頭被雪覆蓋了，無法預知下面的深淺和危險，一不留神就會陷入石頭的夾縫中，扭傷腳腕，這是大家最最擔心又最最害怕的。去大本營的提議已在這無聲的行走中被 PASS，今天能否走出將軍溝順利返回到海西還是個大大的問號，敲打著每個人的心。但大家都很樂觀的預測著翻上以肯奇達板后面的路會好的。 　夏日里的以肯奇達板現(xiàn)在已成為一座白雪皚皚的雪山，此時的博格達峰異常美麗，峰頂彌漫著白色的霧氣，像在云中飄舞的仙子，大家為這美麗的景色驚嘆著。

體力漸漸的不支，可達坂的頂一眼望不到頭，上山的路越來越陡，探路魚一馬當先的在前面沖鋒現(xiàn)陣，為大家開路，垂直距離簡直無法行進，回家的感覺變得那么迫切。如果不能用我的雙腳走上以肯奇達坂，那么我會用我的雙膝爬上去。

我陷入窘境

我們用了整整四個小時登上了在夏天一個小時就可以翻過的達坂。前途變得未知而渺茫，已經(jīng)4點了，想著今天不能趕回去明天的路依然未知，大家沒有―點點翻過達坂面對勝利的感覺。達坂下的路并不樂觀，雪甚至比上山的還厚，我真想卸下背包將它一腳踢下山崖，然后再把自己像個大皮球似的滾下去。夜好似也在趕路，看著漸漸下落的夕陽，所有的希望、所有的信念在這一刻都被瓦解。我拖著沉重的雙腳機械的行走，雪套的鏈子開了，雪灌進了鞋子，雙腳漸漸地冰涼。我已無暇顧及依舊行走，我告訴自己不能停，如果停下來我就會變成雪人留在這里，不能回家。

我想回家!

天已黑了，我的雙手已經(jīng)凍得失去了知覺，左手腫得像塊面包，右手已經(jīng)麻木。“如果不介意就把雙手放進我的懷里，”30說。在這個冰天雪地，前不著村后不著店的地方，我還能介意什么，在這個時刻我還能在去考慮什么，所剩的只是一面之緣的感動。

在30溫暖的胸懷中我的手漸漸地開始恢復了一絲絲的知覺。也許大家會拿這―段來調(diào)侃，但是我一點都不介意，我為路途中的這些深深地感動，那些在徒步的過程中曾經(jīng)因為背著沉重的背包無法自己去系敞開的鞋帶而幫你系過鞋帶的人；曾經(jīng)因為鞋帶凍僵了無法拖下鞋子而沒有給媽媽脫過鞋子而幫你拖下鞋子的人；曾經(jīng)因為雙手失去知覺用自己的胸懷為你捂熱雙手的人。不是每一次都有這樣刻骨銘心的經(jīng)歷，患難見真情，每―次的徒步，無論多么艱難，我的心都是暖的。我對自己說，SUMMER，你是一個堅強、快樂的女孩，永遠像夏天一樣燦爛的女孩，走過了今天，在今后的人生當中還有什么過不去的檻呢，困難算什么呢，困難就是你生活中的小菜。

扎營之后的情況并不樂觀，由于超出了計劃一天，大家都沒有留存多余的食物，四人已經(jīng)斷了口糧，氣罐的火焰也再慢慢地減弱，大家小心翼翼地計劃著晚餐，并為明天未知的前程不覺地保留了僅有的一點點食物。在這荒涼的大山中，無法和外界聯(lián)系，不能不為保持最后的體力留存一些能量。當面臨生存考驗的時候，人的本能可以預知一切的未知。

A、B、C三個計劃

大家在商量著明天的對策，探路負的聲音漸漸清晰。最后終于達成了 A、B、C三個計劃。

夜慢慢的靜下來，未知的路途、不夠一天的能量、即將瀕臨崩潰邊緣的精神。這一夜又是―個思緒萬分的不眠之夜。