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篇1

【關(guān)鍵詞】 腸神經(jīng)嵴干細胞 小鼠 細胞培養(yǎng)技術(shù) 細胞分化 Hirschsprung病

0引言

應(yīng)用神經(jīng)干細胞治療某些神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和退行性疾病，經(jīng)過較長時間的實踐已被證明是行之有效的［1］. 腸神經(jīng)嵴干細胞（gut neural crest stem cells， GNCSCs）起源于神經(jīng)管背側(cè)，具有干細胞特性［2］，將其用于治療先天性巨結(jié)腸癥及腸神經(jīng)系統(tǒng)干細胞疾病的研究已引起人們的關(guān)注，本實驗著重進行GNCSCs的基礎(chǔ)研究，為臨床應(yīng)用建立理論基礎(chǔ).

1材料和方法

1.1材料新生1，5 d昆明小白鼠，15只，體質(zhì)量不拘，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供. ① DMEM/F12完全培養(yǎng)基（Gibco）組成：B27添加劑（Gibco），N2添加劑（Gibco），重組人堿性成纖維細胞生長因子(bFGF， vitrogen)， β巰基乙醇（Sigma），青霉素和鏈霉素（華北制藥）. ② 促分化培養(yǎng)基組成：DMEM/F12完全培養(yǎng)基除bFGF外再添加100 mL/L肽牛血清. ③ 其他：胰蛋白酶、Ⅳ膠原酶（Sigma），左旋多聚賴氨酸（Sigma）. 一抗：兔抗小鼠NGFRp75（武漢博士德）、兔抗Peripherin多克隆抗體(Chemicon)，兔抗GFAP多克隆抗體（DAKO），鼠抗小鼠αActin單克隆抗體（Sigma）SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒（博士得生物工程有限公司）. 二抗為TRITC標記山羊抗小鼠IgG(北京中杉).

1.2方法

1.2.1取材、克隆球的培養(yǎng)頸椎脫臼法處死2組小鼠，將其腸管放入Hanks，清洗，機械分散腸管組織，胰蛋白酶和Ⅳ膠原酶分別消化腸管組織30 min，10 min，終止消化后反復(fù)吹打制成單細胞懸液，用200目，400目的濾網(wǎng)過濾，以800 r/min 離心 5 min，棄上清，用預(yù)先配置的無血清完全培養(yǎng)基重懸細胞，臺盼藍染色計數(shù)活細胞，以 6×108個/L接種到25 mL培養(yǎng)瓶中，添加培養(yǎng)基至4 mL. 在37 ℃， 50 mL/ L CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中水平放置，貼壁培養(yǎng). 原代孵育24 h后棄去漂浮的死細胞，以2/3量換液，孵育3 d后進行傳代，以6×108個/L接種到25 mL培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)孵育40~48 h后再次傳代，如有細胞團塊形成則以1代/1~2 d的速度傳代，3代之后可形成圓形的克隆球.

1.2.2克隆球的分化用含100 mL/L胎牛血清的完全培養(yǎng)基重懸傳代5次后的克隆球，接種于放置有預(yù)先包被左旋多聚賴氨酸蓋玻片的35 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿2 mL，動態(tài)觀察克隆球的分化情況.

1.2.3克隆球及其分化細胞特異性標志物的染色應(yīng)用p75NTR， GFAP， Peripherin，αActin抗體分別檢測克隆球及其分化細胞系的性質(zhì)，封片后分別用光學(xué)顯微鏡和激光共焦顯微鏡取圖.

轉(zhuǎn)貼于

2結(jié)果

2.1克隆球的生長狀況接種初期，倒置顯微鏡下觀察到單細胞和一些呈半球狀或不規(guī)則的細胞團. 孵育24 h后，貼壁細胞胞呈圓形，胞體小，折光性好，部分貼壁細胞胞體增大，折光性增強，出現(xiàn)分裂相，形成2～5個細胞的細胞團，另一部分呈聚集生長. 3 d后形成十幾或數(shù)十個細胞構(gòu)成的克隆球(圖1A)，克隆球增大的同時向周圍伸出放射狀的細胞索，形成較小的次級克隆，這些克隆球形態(tài)完整，折光性減弱，周邊界線清晰，但其中心密集，界限不清，無法觀察到完整的細胞結(jié)構(gòu) （圖1B）. 重新傳代培養(yǎng)，可觀察到細胞胞體增大，出現(xiàn)分裂相的克隆球數(shù)量逐漸增多，雜質(zhì)細胞減少，在連續(xù)傳代過程中克隆球逐漸純化.

2.2克隆球的分化接種含血清培養(yǎng)基12 h后，可見有細胞從克隆球中遷出，遷出的細胞貼壁生長；24 h后克隆球變扁，遷移出的細胞增多，相差顯微鏡下難以分別形態(tài)；48 h后貼壁細胞數(shù)量明顯增加，逐漸形成單細胞層且細胞形態(tài)多元化.

2.3克隆球及其分化細胞系的免疫染色免疫細胞化學(xué)方法進行p75， Peripherin， GFAP， αActin免疫染色（圖1C，圖2， 3）.

3討論

許多研究表明GNCSCs在ENS的發(fā)生和發(fā)育起關(guān)鍵作用［3-4］. 目前HSCR的病因與RET等8種基因密切相關(guān)［4-5］，在RET等基因缺失模型中， GNCSCs的生存、增殖、遷徙及分化等功能發(fā)生障礙，受累腸道的相應(yīng)神經(jīng)節(jié)出現(xiàn)缺失，表明先天性巨結(jié)腸可能是一種干細胞疾病. 由于HSCR及腸神經(jīng)系統(tǒng)干細胞性疾病在手術(shù)治療后仍遺留有嚴重的并發(fā)癥，因此用干細胞來進行臨床治療已成為研究的熱點和重點. 鑒于胚胎干細胞的來源限制及免疫排斥問題，成體GNCSCs的研究將為今后的移植試驗提供新契機.

GNCSCs的培養(yǎng)方法建立在中樞神經(jīng)干細胞的基礎(chǔ)上. 依據(jù)神經(jīng)干細胞經(jīng)典的培養(yǎng)方法，再結(jié)合GNCSCs“收獲率”低、難以分離純化的特點，聯(lián)合應(yīng)用簡化的特殊培養(yǎng)劑和神經(jīng)干細胞培養(yǎng)方法進行體外培養(yǎng). 連續(xù)傳10代后，GNCSCs的相對比例明顯增加，這種體外培養(yǎng)的方法能有效地分離和純化GNCSCs，但并不能完全消除其他細胞. 如果繼續(xù)傳代，其純化程度越高，后續(xù)的試驗效果將更佳. 連續(xù)傳代不僅純化了GNCSCs，還證實了干細胞的自我更新特性. 在體外培養(yǎng)干細胞時，培養(yǎng)條件稍有變化可導(dǎo)致分化機制的啟動，因此采用血清促分化法誘導(dǎo)GNCSCs分化既簡單又可靠. 通過免疫染色，證實了GNCSCs分化細胞的類型，同時顯示了分化的亞型神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞的形態(tài)，并表明了成體干細胞的多向分化能力.

參考文獻

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［2］ Newgreen D， Young HM. Enteric Nervous System: development and developmental disturbancespart2［J］. Pediatr Dev Pathol，2002， 5(4): 329-349.

篇2

目的 建立Wistar大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）分離、培養(yǎng)的方法，并進行鑒定、標記。方法 采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)大鼠的MSCs。采用相差顯微鏡觀察MSCs的形態(tài)學(xué)特征；流式細胞儀檢測第3代細胞表面標志抗原CD29、CD44、CD34和CD45的表達率；電鏡檢查第3代MSCs超微結(jié)構(gòu)。DAPI標記MSCs為下一步進行體內(nèi)細胞移植示蹤。結(jié)果 原代培養(yǎng)的MSCs于6～8 h后貼壁，6 d左右形成集落，14 d 左右可達到80%～90%融合。第3代細胞表面標記物CD29，CD44，CD34和CD45的陽性率分別為98.6 %，78.2%，0.0%，0.3%。超微結(jié)構(gòu)清晰，可見細胞器，如線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體，細胞核呈圓形或不規(guī)則，可見較多微絨毛。DAPI可良好標記MSCs細胞核，呈藍色熒光。結(jié)論 采用全骨髓貼壁培養(yǎng)的方法能夠成功分離和培養(yǎng)大鼠的MSCs，在第3代可獲得高純度MSCs。DAPI可以作為一種示蹤劑標記MSCs。

【關(guān)鍵詞】 細胞培養(yǎng)；間充質(zhì)干細胞；種子細胞；示蹤劑

【Abstract】 Objective To establish a method for isolation and culture of bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs) from Wistar rats in vitro，and to identify characteristic of the cells and to label them after culture expansion.Methods MSCs were isolated and cultivated from the bone marrow of Wistar rats by adherent method.The morphology of MSCs was observed under phase contrast microscope.The expression of CD29 ， CD44 ， CD34 and CD45 of the third generation cells were analyzed by flow cytometry. Electron microscopic features were also observed and MSCs were labeled by DAPI. Results After 6 to 8 h primary culture ， MSCs adhered to plastic surface of the culture dish. 　About 6 d later ， the cells proliferated in colonies.Primary MSCs reached 80%～90%of confluence in 14 d approximately.The positive rates of CD29 ， CD44 ， CD34 ， and CD45 in MSCs at third generation were 98.6% ，78.2% ，0.0% ， and 0.3% respectively. Under the electron microscope MSCs had plentiful cytoplasm with mitochondria rough endoplasmic reticula and Golgi complexes.Their nuclei were round or irregular and there were plenty of microvilli on the surface. All of the MSCs after labeling by DAPI showed blue fluorescence by fluoroscope.Conclusions Mesenchymal stem cells can be successfully isolated and cultivated by adherent method.And higher purity MSCs can be picked up after culture expansion at P3. DAPI can be an effective tracer agent to label MSCs.

【Key words】 Cell culture;Mesenchymal stem cells;Seed cells; Tracer agent

骨髓間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類具有自我更新和多向分化潛能的非造血干細胞，可以向骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、干細胞、肌細胞、神經(jīng)細胞以及心肌細胞分化〔1，2〕，具有高度可塑性，易于體外擴增，因其來源充足、取材方便，體外增殖能力相對較強，而且在異體移植中排斥反應(yīng)小，被認為是組織工程和基因工程的理想種子細胞，為心血管疾病、神經(jīng)疾病和骨關(guān)節(jié)疾病的治療提供了一條全新的治療方案。本文在總結(jié)貼壁分離法培養(yǎng)MSCs的基礎(chǔ)上，優(yōu)化MSCs純化、鑒定、標記的方法，以獲得穩(wěn)定的培養(yǎng)體系，為應(yīng)用組織工程技術(shù)提供大量的種子細胞。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級雄性Wistar大鼠(3周鼠齡，60～70 g)，吉林大學(xué)動物實驗中心提供。

1.2 主要試劑和藥品

低糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，特級胎牛血清(Gibco公司)，胰酶(Sigma公司)，亞美尼亞倉鼠抗大鼠CD29Alexa Fluor (Biolegend公司)，小鼠抗大鼠CD45過氧化物酶（FITC）(Biolegend公司)，小鼠抗大鼠CD44PE (Santa Cruz 公司)，小鼠抗大鼠CD34FITC(Santa Cruz公司)，46二脒基2苯基吲哚（DAPI）儲存液(Sigma 公司)。

1.3 分離和培養(yǎng)

Wistar大鼠麻醉后處死，浸泡酒精15 min，無菌條件下分離股骨、脛骨，無血清DMEM沖洗骨髓腔，取混懸液，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀含10%胎牛血清的DMEM混懸，將獲得的細胞接種在100 ml培養(yǎng)瓶中，5% CO2，37℃下培養(yǎng)24～48 h，換液，去除未貼壁細胞，2～3 d更換一次培養(yǎng)基，光鏡觀察細胞融合情況，細胞80%融合后傳代，0.25%胰酶消化，用血球計數(shù)儀計數(shù)細胞、傳代，培養(yǎng)3～5代細胞。

1.4 透射電鏡樣品制備

將培養(yǎng)3代10 cm2培養(yǎng)皿中約2×106個細胞以磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次，再以3 %戊二醛4℃固定1 h，送電鏡室，脫水包埋并制作超薄切片，行透射電鏡觀察并拍照。

1.5 MSCs表面標記物檢測

0.25%胰酶消化收獲第3代細胞，收集1×106個細胞，洗滌1次，0～4℃預(yù)冷的70%乙醇1 ml邊加入邊搖勻，混勻后置于4℃冰箱待進行細胞表面標記物檢測。檢測時以1 ml PBS洗滌2次，加含10%山羊血清的 PBS常溫孵育10 min，1 000 r/min離心5 min去上清，與飽和濃度的CD29Alexa Fluor、CD34FITC、CD44PE、CD45FITC單克隆抗體及其同型對照混勻，室溫下閉光反應(yīng)30 min，PBS 洗滌細胞，置于冰上，行流式細胞儀檢測。

1.6 MSCs標記

將無菌的DAPI 儲存液加入培養(yǎng)的MSCs爬片上清中，至終濃度為50 mg/L ，37 ℃孵育染色至少30 min。細胞至少用Hanks 平衡鹽溶液沖洗6 遍以除去未結(jié)合的DAPI。熒光顯微鏡下觀察細胞爬片。

2 結(jié) 果

2.1 MSCs相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)

骨髓細胞接種于培養(yǎng)瓶后，約6～8 h可見MSCs細胞貼壁，呈圓形或多角形，換液后，貼壁細胞清晰可見，2～3 d后可見少量短梭形、星形細胞分散貼壁生長，伸出偽足呈逗點狀或短棒狀；6 d左右可見放射狀排列的細胞集落，伸出長短不一、粗細不均的突起、胞核大、核仁清晰。約14 d細胞融合80%～90%，呈漩渦狀。傳代細胞比原代細胞貼壁快，24 h內(nèi)已全部貼壁、伸展，增殖迅速，均勻分布生長，3～4 d可見長梭形細胞80%～90%鋪滿培養(yǎng)皿形成單層。見圖1。

2.3 MSCs的鑒定及標記

第3代細胞表面標記物CD29、CD44、CD34和CD45的陽性率分別為98.6 %、78.2%、0.0%、0.3%。見圖3。細胞經(jīng)DAPI標記后，細胞核呈藍色。見圖4。

3 討 論

由于骨髓的細胞組成復(fù)雜，細胞功能各異，其中MSCs含量很低，約為骨髓低密度組分中有核細胞的0.001%～0.01%〔3〕，故分離高純度的MSCs是原代培養(yǎng)關(guān)鍵性技術(shù)。目前，獲得MSCs的方法主要有貼壁篩選法、密度梯度離心法、流式細胞儀分離法、免疫磁珠分選法〔4〕。而骨髓貼壁法操作步驟簡單，既降低了離心對細胞的損害，又減少了污染機會，且分離的MSCs貼壁時間短，增殖快，細胞數(shù)量多，經(jīng)傳代后能夠純化，提示全骨髓貼壁法是一種更加簡單有效的MSCs分離方法。

一般認為，間充質(zhì)干細胞沒有特異性表面抗原，整合素家族成員CD29、黏附分子CD44、CD166、CD105等是MSCs的重要標志物〔5〕，而MSCs不表達造血細胞表面抗原，如造血前體細胞標志抗原CD34、成熟造血細胞標志抗原CD38、白細胞標志抗原CD45、淋巴細胞表面抗原CD11a和單核細胞/巨噬細胞表面抗原CD14。因此，實驗選取MSCs表達陽性的指標CD29、CD44，以及表達陰性的指標CD34和CD45作為鑒定參考指標〔2，6〕。本研究選擇了CD29、CD34、CD44和CD45進行檢測，結(jié)果表明培養(yǎng)的細胞CD29和CD44陽性，CD34和CD45陰性，符合MSCs的特點，經(jīng)過傳代，第三代可獲得較高純度的MSCs，可以作為穩(wěn)定的種子細胞進行體內(nèi)研究。

DAPI是一種能夠與DNA強力結(jié)合的熒光染料，常用于熒光顯微鏡觀測。DAPI對活細胞無毒性，不改變細胞器的超微結(jié)構(gòu)，熒光保持時間較長。移植細胞的標記是研究其在體內(nèi)的定位不可缺少的，目前常用的標記法有DAPI標記法、溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）標記法、染色體標記法、基因標記法。BrdU法存在只能標記增殖期細胞，且標記細胞不能直接觀察等不足。染色體標記主要將雄性供體動物細胞移植到雌性動物體內(nèi)，通過Y染色體雜交區(qū)別確認移植細胞。其優(yōu)點在于可以終生標記，但也存在操作繁瑣，無法觀察活細胞等不足?；驑擞浄ㄍㄟ^基因轉(zhuǎn)染或直接從轉(zhuǎn)基因動物取材，使被標記細胞攜帶綠色熒光蛋白（GFP）暼報告基因。但目前，實現(xiàn)報告基因在目的細胞中高效穩(wěn)定表達仍然存在程序繁瑣、實驗周期長、成功率低等困難，而從轉(zhuǎn)基因動物取材又因為動物來源困難，在國內(nèi)較少開展〔7〕。本研究表明，DAPI起初標記率很高(接近100%)，1 w內(nèi)可維持80%～90%標記率。但隨著標記時間的延長，其標記效率迅速下降，3 w以后絕大多數(shù)細胞失去標記。

本實驗完善貼壁法建立Wistar大鼠MSCs培養(yǎng)體系，經(jīng)鑒定細胞純度高，可以為體內(nèi)移植提供大量的種子細胞。采用DAPI 進行細胞標記后，熒光顯微鏡下見所有MSCs 均已被標記藍色熒光，提示DAPI 標記法敏感性好，標記效率高，可應(yīng)用進行體內(nèi)細胞移植的良好標記。

參考文獻

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篇3

自lichter等[1]1981年首次報道了甘藍型油菜游離小孢子培養(yǎng)并成功獲得了再生苗,在后來的20多年里,國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)成功地在甘藍型油菜中建立了小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系,特別是用此種方法從培育的dh群體中獲得的多種油菜品種已經(jīng)在生產(chǎn)中得到了廣泛的認可。現(xiàn)將甘藍型油菜小孢子加倍培養(yǎng)技術(shù)介紹如下。

1選取花蕾

一般在天氣晴朗的8~10時取材,如遇陰雨天氣,為了不影響試驗進程也可取材,但一定要選取生長良好的花序,研究報道低溫有利于小孢子的胚胎發(fā)生。盡量選取主花序或生長狀態(tài)較好的花序,然后在實驗室選取大小在2.5~3.5mm的花蕾備用。不同的材料花蕾的發(fā)育時期不盡相同,可以剝蕾挑取小孢子進行鏡檢以確定發(fā)育時期,最佳時期為單核晚期至二核期。花藥為淡綠色呈透明狀。取蕾以后如果不能立刻進行小孢子的提取,應(yīng)將花蕾放置于濕潤的條件下低溫保存。

2游離小孢子分離

先用75%的醫(yī)用酒精將花蕾表面滅菌30～60s,再用0.1%升汞消毒花蕾表面15min,再用無菌水沖漂洗3次,每次5min。將消毒的花蕾置于滅過菌的玻璃管中,加約2ml b5提取液,用滅菌玻璃棒將花蕾研碎,壓出花粉小孢子,通過2層槽式無菌濾紙,或45μm的尼龍網(wǎng),或0.22μm孔徑的微孔濾膜過濾,把濾液倒入滅菌了的帶蓋的10ml離心管里,用滴管吸b5抽提培養(yǎng)液沖洗過濾器中的花粉,沖2~3次后,在10ml離心管中將花粉懸浮液稀釋;將花粉懸浮液離心,800rpm,離心5min;將離心管中的上層清液吸去,再加液體b5抽提液,并將沉淀的花粉用吸管沖散,再次懸浮離心(用封口膜封口),1 800rpm,離心5min,吸去上層清液。

3小孢子加倍培養(yǎng)

將沉淀的花粉用nln-16 液體培養(yǎng)基稀釋,稀釋不要超過10ml,因為加倍后還要在10ml的離心管中再次稀釋離心,倒入三角瓶在32℃條件下暗培養(yǎng)2d左右(48~72h);然后檢查是否有污染,如果沒有污染,則分皿繼續(xù)培養(yǎng)。

4胚誘導(dǎo)培養(yǎng)

將加倍后的nln-16花粉懸浮液倒入離心管離心,800rpm,離心5min,倒掉nln-16液體;將沉淀的花粉用nln-13培養(yǎng)液稀釋,稀釋后的懸浮液分裝入7.5cm培養(yǎng)皿,一般每皿加入懸浮液3ml左右,含花蕾1.5~2.0個/ml,小孢子密度為10~50萬個/ml,用封口膜封口;將封口的培養(yǎng)皿在25℃的條件下進行暗培養(yǎng),10d左右開始查看是否有可見的顆粒狀胚,如果沒有則繼續(xù)培養(yǎng)[2]。

5胚狀體培養(yǎng)

當(dāng)肉眼可見的小胚狀體出現(xiàn)時,把培養(yǎng)皿放在搖床上振蕩暗培養(yǎng)5~7d,轉(zhuǎn)速為80～100rpm。然后將魚雷形、子葉形胚狀體移植到b5固體培養(yǎng)基上,在25℃光暗交替條件下持續(xù)培養(yǎng),誘導(dǎo)植株再生[3]。

6再生苗培養(yǎng)

培養(yǎng)1~2周后,見到子葉長大變綠,胚根伸長,長滿白色根毛。繼續(xù)培養(yǎng)后形成真葉,胚根不再伸長。當(dāng)達到3～4片真葉時,再轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上生根,或在附加1mg/l 6-ba的b5培養(yǎng)基上進行扦插繁殖,獲得完整植株。

7再生植株倍性鑒定

對再生植株進行細胞學(xué)鑒定(染色體數(shù)目)或在開花以后根據(jù)花器形態(tài)(雄蕊和花瓣形態(tài))進行鑒定[4-7]。若是單倍體植株,需要再加倍培養(yǎng)成雙倍體,可以把帶有秋水仙堿溶液的脫脂棉蓋在植株的頂芽、腋芽上;或者初花期把單倍體植株從土壤中取出,洗凈根部泥土后用0.2%～0.4%秋水仙堿溶液泡1.5～8.0h,再移栽田間;或者胚狀體再生獲得的試管苗,在含10～100mg/l秋水仙堿的b5液體培養(yǎng)基中無菌培養(yǎng)4～8d,轉(zhuǎn)到無秋水仙堿的b5培養(yǎng)基中培養(yǎng)7～14d,然后移栽到土壤中[8,9]。

8參考文獻

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[2] 石淑穩(wěn),周永明,吳江生,等.

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篇4

為此，在2010年，山東信得專門成立動物疫苗有限公司，并投資1.5億元建成了國內(nèi)首家大規(guī)模細胞懸浮培養(yǎng)工藝生產(chǎn)高致病性禽流感滅活疫苗的GMP車間，并于次年初通過了農(nóng)業(yè)部的GMP動態(tài)驗收，獲得GMP證書和獸藥生產(chǎn)許可證。2012年，山東信得獲得農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的禽流感細胞苗新獸藥證書。

“此次獲得重組禽流感病毒（H5N1亞型）滅活疫苗的生產(chǎn)文號，標志著山東信得研發(fā)生產(chǎn)的產(chǎn)品將由此進入規(guī)模生產(chǎn)階段，并能面向市場供應(yīng)?！鄙綎|信得有關(guān)負責(zé)人表示，同時也說明了細胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)打破多年來動物疫苗生產(chǎn)行業(yè)一直采用雞胚生產(chǎn)禽流感疫苗的技術(shù)瓶頸，標志著我國在禽流感疫苗的研發(fā)和生產(chǎn)方面，已經(jīng)走到了世界技術(shù)前沿，具有極大的引領(lǐng)和示范作用。

篇5

【關(guān)鍵詞】 乙醇 肝細胞 原代培養(yǎng) 柴胡皂苷-d 保護作用 機制

隨著人們生活水平的提高和飲酒量的增加，酒精對肝臟的損害日漸突出。了解酒精對肝損傷的機制，篩選有效預(yù)防和治療酒精性肝損傷的藥物應(yīng)用于臨床，是亟待解決的重要課題。目前，中藥復(fù)方對酒精性肝損傷的實驗研究和報道比較多，單味制劑報道較少。柴胡皂苷（saikosaponins SS）是中藥柴胡的有效成分，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)不同可分為柴胡皂苷a、柴胡皂苷b、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d等，以柴胡皂苷d(SS-d)藥理活性作用最強。整體水平研究表明柴胡皂苷對酒精性肝損傷有預(yù)防作用［1］。本文建立體外乙醇損傷肝細胞模型，在細胞水平上進一步研究柴胡有效成分SS-d對乙醇損傷肝細胞的保護作用機制。

1 器材與方法

1.1 藥品與試劑 SS-d（純度98%），昆明長春花科技有限公司提供，臨用前以蒸餾水配制；Hanks液高壓滅菌，4℃保存；1.0 g·L－1胰蛋白酶，用Hanks液溶解，過濾除菌，調(diào)pH 7.2，分裝，-30℃保存；基礎(chǔ)培養(yǎng)液，RPMI1640培養(yǎng)基10.0 g，用超凈水900 ml溶解，5.6%NaHCO3調(diào)pH至7.2，定溶到1 000 ml，過濾除菌，臨用前每80 ml，加入新生小牛血清20 ml，青霉素100 U·ml－1，鏈霉素100 μg·ml－1，胰島素5 μg·ml－1；MTT：SIGMA公司；ALT，MDA，GSH-px測定試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 動物 SD大鼠，2～4 d齡乳鼠，雌雄不限，清潔級，承德醫(yī)學(xué)院實驗動物管理中心提供。

1.3 儀器 CO2培養(yǎng)箱（Taibai LNA-122D 日本），MD-100半自動生化分析儀（美國Bayer公司），721W微機型分光光度計（上海光學(xué)儀器五廠），離心機（TGL.16G 上海）。

1.4 肝細胞分離培養(yǎng)［2］取新生2～4 d大鼠30只，75%乙醇浸洗后斷頭放血，無菌分離肝臟，去除肝臟外膜及其周圍結(jié)締組織，置Hanks液中，灌注沖洗肝臟至灰白色，將肝臟剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的組織塊，用Hanks沖洗數(shù)次，除去血細胞，加入0.8g·L－1胰蛋白酶10 ml，37℃孵育12 min，加入數(shù)滴血清終止消化，用滴管輕吹打成細胞懸液，經(jīng)200尼龍篩網(wǎng)過濾后用培養(yǎng)液洗2次，1 000 r離心5 min，收集肝細胞，臺盼藍活細胞計數(shù)>85%，按1 ×109個·L-1接種于鋪有鼠尾膠原的24孔和96孔板中，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液去除血細胞，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后進行分組實驗。

1.5 乙醇誘導(dǎo)肝細胞損傷模型的建立將含肝細胞培養(yǎng)液的96孔板，設(shè)正常對照組及乙醇25，50，75，100 mmol ·L－14個劑量組，肝細胞懸液與不同濃度乙醇繼續(xù)培養(yǎng)12 h，取培養(yǎng)液按賴氏法測定ALT活性，MTT法測定肝細胞存活率。

1．6 MTT法選擇SS-d的實驗濃度 SS-d初濃度為5 mg/L，采用細胞培養(yǎng)液進行稀釋，依次為5.0 ，4.0，3.0 ，2.0 ，1.0 ，0.5 mg·L－1。將肝細胞接種于96孔板培養(yǎng)72 h更換培養(yǎng)液，換用SS-d稀釋液培養(yǎng)，另設(shè)空白對照組，12 h后吸出培養(yǎng)液，各孔加入0.05%MTT200 μL，37℃孵育4 h，去上清液，各孔加入二甲基亞砜200 μl，混勻以溶解被還原的MTT結(jié)晶，檢測波長為492 nm的光密度值，計算藥物不同稀釋濃度下細胞的存活率。

1.7 SS-d對乙醇誘導(dǎo)肝細胞損傷的保護作用取培養(yǎng)72 h肝細胞，設(shè)乙醇損傷模型組、SS-d(1 .0，2 .0，3.0mg·L－1)3個劑量保護組、正常對照組，每組設(shè)8個復(fù)孔。模型組和SS-d組加入乙醇100 mmol·L－1，同時SS-d組加入不同濃度的SS-d，正常對照組加不含血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，收集培養(yǎng)上清液檢測ALT活性，收集肝細胞檢測MDA含量和GSH-px的活性，MTT法測定肝細胞的存活率。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)以 表示，用SPSS計算機軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析， 組間比較采用t檢驗，P

2 結(jié)果

2.1 乙醇對原代培養(yǎng)肝細胞的損傷不同濃度的乙醇作用于肝細胞，對細胞有劑量依賴性的損傷作用，25 mmol·L－1作用不明顯，光鏡下細胞形態(tài)基本正常，隨著濃度的增大，肝細胞存活率呈進行性降低，反映肝細胞損傷的酶ALT逐漸升高；鏡下觀察肝細胞損傷明顯，細胞結(jié)構(gòu)不清，核融解和核膜破裂，其中100 mmol ·L－1乙醇作用最明顯，我們選擇乙醇濃度為100 mmol ·L－1制備肝細胞損傷模型。見表1。表1 不同濃度乙醇對肝細胞ALT水平及細胞存活率的影響 與空白對照組比較#P＜0.05，##P＜0.01；n=6

2.2 SS-d 實驗濃度的選擇SS-d不同濃度時細胞存活率見表2，為避免藥物濃度過大所致的細胞毒性作用，應(yīng)選擇對細胞生長無明顯影響即肝細胞存活率在90%以上的濃度(1.0 ，2.0 ，3.0 mg·L-1)作為實驗所用藥物濃度。見表2。表2 不同濃度SS-d對肝細胞存活率的影響與空白對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；n=6

2.3 SS-d對乙醇損傷肝細胞的保護作用 100 mmol·L－1乙醇作用肝細胞后，肝細胞損傷明顯，大量細胞壞死，細胞內(nèi)ALT釋放量明顯升高，細胞內(nèi)MDA含量明顯增高，GSH-px活性明顯下降；而給予SS-d保護后， 培養(yǎng)液中ALT水平明顯降低；肝細胞MDA含量明顯降低，GSH-px活性明顯升高；并且肝細胞存活率明顯升高。具有明顯的劑量依賴性(P＜0.05，P＜0.01)。表明：SS-d能夠保護肝細胞、穩(wěn)定肝細胞膜的結(jié)構(gòu)，其保護作用可能與抗脂質(zhì)過氧化作用有關(guān)。見表3。表3 SS-d對乙醇損傷肝細胞ALT，MDA，GSH-px水平與對照組比較，*P＜0.01，與模型組比較#P＜0.05，##P＜0.01；n=6

3 討論

大量研究表明，乙醇對肝細胞損傷是通過自由基介導(dǎo)脂質(zhì)過氧化作用進行的［3～5］。乙醇在肝臟代謝時產(chǎn)生大量自由基，自由基除直接損傷肝細胞外，可引起肝細胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使細胞膜和細胞器結(jié)構(gòu)破壞，膜流動性失常，大量肝內(nèi)酶（ALT，AST）釋放入血，并可抑制抗氧化劑谷胱甘肽的合成，減弱抗氧化酶（GSH-px）的抗氧化能力，使肝細胞代謝紊亂，肝功能異常，肝細胞廣泛脂肪樣和空泡樣變性，最終導(dǎo)致細胞腫脹死亡［6］。因此，清除自由基抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，才能保護肝細胞，恢復(fù)肝細胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性。

SS是柴胡的主要成分，研究表明，SS對實驗性肝損傷具有明顯的保護作用［7，8］。但對單體SS－d保肝作用研究報道較少。因此，我們利用乙醇制備體外肝細胞損傷模型，在細胞水平上對SS-d保肝作用機制進行探討。本研究顯示，模型組肝細胞培養(yǎng)液中ALT活性明顯升高，肝細胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物MDA含量增加，GSH-px活性降低，細胞存活率明顯下降，表明乙醇可引起肝細胞氧化損傷；給予SS－d保護后，和模型組比較，肝細胞培養(yǎng)液中ALT活性明顯較低，MDA含量明顯降低，GSH-px活性明顯升高，肝細胞存活率亦有明顯升高。提示，SS-d對乙醇損傷肝細胞有明顯保護作用，其機制可能是：①SS-d能增強機體內(nèi)抗氧化防御能力，抑制自由基的產(chǎn)生；②穩(wěn)定肝細胞膜系統(tǒng)，提高膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，促進肝細胞增殖，防止肝細胞損傷和壞死。

【參考文獻】

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［2］ 謝華福，甘 淋，李 娟，等. 一種簡單的肝細胞分離、培養(yǎng)和鑒定方法［J］.瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2003，26（4）：306.

［3］ Sergent O，Pereira M，Belhomme C，et al.Role for membrane fluidity in ethanol-induced oxidative stress of primary rat hepatocytes［J］. J Pharmacol Exp Ther，2005，1:5.

［4］ Stewart SF，Vidali M，Day CP，et al.Oxidative stress as a trigger for cellular responses in patients with alcoholic liver disease［J］. Hepatology，2004，39:197.

［5］ 鄧 源，班春林，武曉瓊. 乙醇誘導(dǎo)肝損傷作用機制的研究進展［J］. 華北國際醫(yī)藥，2005，17（4）:242.

篇6

一、MDCK 細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)

細胞的懸浮培養(yǎng)可謂是理想的大規(guī)模細胞培養(yǎng)方式，懸浮培養(yǎng)技術(shù)是在生物反應(yīng)器中，在人工條件下，高效率大規(guī)模的培養(yǎng)動物細胞進而應(yīng)用于生物制品生產(chǎn)的技術(shù)，可根據(jù)細胞的貼壁能力分為微載體懸浮培養(yǎng)方式和全懸浮培養(yǎng)方式。

1. 微載體懸浮培養(yǎng)。MDCK 細胞是從犬腎分離出來的一種貼壁依賴性上皮細胞，且它具有典型的“失巢凋亡”現(xiàn)象，即一種特殊的細胞程序死亡，是由于細胞與細胞外基質(zhì)或相鄰細胞脫離接觸而誘發(fā)的，也就是說依靠傳統(tǒng)的馴化方式或者單純的用機械攪拌使MDCK 細胞懸浮生長難度相當(dāng)大。Van Wezel 創(chuàng)立的微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)開創(chuàng)了細胞體外大規(guī)模培養(yǎng)的先河，更為準確的說是使貼壁細胞大規(guī)模培養(yǎng)成為現(xiàn)實。微載體懸浮培養(yǎng)是一種先進的貼壁細胞培養(yǎng)技術(shù)，其原理是將對細胞無害的顆粒加入到生物反應(yīng)器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細胞能在微載體表面附著生長，同時加以持續(xù)攪動使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。反應(yīng)器中使用微載體是一種可以提高細胞濃度的策略，其細胞密度可達1×107 cells/ml。

采用微載體培養(yǎng)MDCK 細胞，結(jié)合了懸浮培養(yǎng)與貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點，包括（1）細胞貼壁表面積大大增加，培養(yǎng)基利用充分，細胞密度增大。（2）微載體可在攪拌停止時沉降，便于將培養(yǎng)基與細胞分離。（3）與方瓶貼壁培養(yǎng)時的代謝變化不大，正常培養(yǎng)基可通用等等。

但是，目前生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)研究只是單批次的培養(yǎng)，其消化放大培養(yǎng)依舊是難題。且微載體培養(yǎng)過程中一般添加了血清，給下游純化帶來了巨大壓力。采用商業(yè)無血清培養(yǎng)基，會大大增加企業(yè)生產(chǎn)成本。因此，自主開發(fā)無血清培養(yǎng)基進行MDCK 細胞懸浮培養(yǎng)是目前的發(fā)展趨勢。

2. 無血清單細胞懸浮培養(yǎng)。我們知道，生物制品生產(chǎn)尤其是細胞培養(yǎng)方法生產(chǎn)病毒疫苗的過程十分嚴謹。細胞培養(yǎng)需添加血清，可是血清的加入無疑給生產(chǎn)后期的除雜純化等工藝帶來難度，而且，流感病毒血凝素HA 可被宿主蛋白酶裂解為成熟的HA1 和HA2，能夠介導(dǎo)病毒囊膜和靶細胞膜結(jié)合，病毒開始繁殖，而MDCK 細胞本身不具備裂解HA 的蛋白酶類，所以常常添加胰蛋白酶來提高病毒產(chǎn)量，但是，細胞培養(yǎng)中的血清恰好又可以中和胰蛋白酶，這種矛盾致使MDCK 無血清培養(yǎng)問題更亟需解決。目前，MDCK 無血清培養(yǎng)已經(jīng)取得了很大的進展，基本思路是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上補加各種生物活性因子來替代血清，結(jié)合細胞生長所需成分，配制出無血清培養(yǎng)基， 能夠支持MDCK 細胞正常生長增殖。一般常見的營養(yǎng)添加因子有：胰島素，人轉(zhuǎn)鐵蛋白，氫化可的松等等，再經(jīng)過對這些添加因子的添加量的優(yōu)化，最終確定無血清培養(yǎng)基成分。

現(xiàn)在，已有MDCK 細胞商業(yè)用無血清培養(yǎng)基，它們的成功問世解決了這一大難題。通過直接法或間接法，即：原含血清培養(yǎng)貼壁細胞直接消化傳代換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)或逐步降低血清濃度直至降到無血清培養(yǎng)，使MDCK 細胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)基，生長狀態(tài)優(yōu)良且能正常增殖傳代。

完成了MDCK 無血清培養(yǎng)后，MDCK 單細胞懸浮培養(yǎng)仍在研究當(dāng)中，有文獻報道，已有馴化成功的MDCK 懸浮細胞系，但就市場應(yīng)用來看，是遠遠不夠成熟的?，F(xiàn)階段，馴化MDCK 細胞在適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，對其進行單細胞懸浮培養(yǎng)馴化方法主要有以下幾種：（1）使用硅化方瓶培養(yǎng)：將細胞培養(yǎng)方瓶先用硅化劑處理，防止了細胞的貼壁，再通過調(diào)整培養(yǎng)基成分，使細胞增殖；（2）使用搖床或搖瓶體系，通過外力作用，防止細胞貼壁，再對細胞進行篩選，然后擴大培養(yǎng)。

二、 MDCK 細胞應(yīng)用于流感病毒疫苗生產(chǎn)

采用細胞系培養(yǎng)流感病毒是目前最有前景的流感疫苗生產(chǎn)方法，市場銷售的一些貼壁細胞系如Vero 細胞，MDCK 細胞是應(yīng)用于流感疫苗研究最典型的哺乳動物細胞系，經(jīng)研究，這些宿主細胞產(chǎn)生的病毒滴度高，大部分病毒繁殖效果好。此外，研究表明，從相應(yīng)的細胞培養(yǎng)生產(chǎn)的疫苗免疫應(yīng)答效果和用雞胚生產(chǎn)的疫苗一樣好。MDCK 細胞應(yīng)用于流感疫苗生產(chǎn)有很多優(yōu)點：MDCK細胞易培養(yǎng)、增殖快、易放大，感染流感病毒效率高，可高效擴增流感病毒；MDCK 細胞生產(chǎn)的疫苗可以應(yīng)用于對雞胚蛋白過敏的患者等等。在使用MDCK 貼壁細胞接流感病毒后，通常會有較高的細胞特異性產(chǎn)率；微載體懸浮培養(yǎng)的MDCK細胞，接流感病毒后，HA 滴度可以高達9log2（1∶512）；就已知實驗室用馴化出MDCK 懸浮細胞系接流感病毒，得出的TCID50 值和HA 滴度都高于貼壁細胞系。且已有疫苗廠商如Solvay 制藥公司采用無血清培養(yǎng)基、微載體技術(shù)制備出了MDCK細胞流感亞單位疫苗；諾華公司制備出了由MDCK 細胞培養(yǎng)生產(chǎn)的流感疫苗Optaflu。

三、展望

在過去十幾年中，用動物細胞培養(yǎng)制備流感疫苗生產(chǎn)方式已經(jīng)替代了傳統(tǒng)的使用雞胚生產(chǎn)方式。動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)流感疫苗的特征在于其靈活性和可擴展性，然而，貼壁細胞易培養(yǎng)但是卻很難擴大生產(chǎn)量，而如果使用微載體提供生長表面又會大大增加其成本。所以要努力創(chuàng)建懸浮細胞系，特別是MDCK懸浮細胞系。

多年以來，監(jiān)管部門督促行業(yè)設(shè)立無血清培養(yǎng)流程，以避免污染。

然而，許多市售培養(yǎng)基仍然需要添加物，以達到高細胞密度和最大產(chǎn)物產(chǎn)量。理想的情況是，在疫苗生產(chǎn)中應(yīng)該使用不需添加另外的蛋白質(zhì)等混合物的已知成分的培養(yǎng)基。這不僅會降低批次變化的風(fēng)險也有利于病毒收獲的下游處理。此外，疫苗生產(chǎn)過程可以被簡化，可以直接接毒而不用更換培養(yǎng)基。

篇7

【中圖分類號】R587.1 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004-7484（2013）03-0044-02

引言

研究表明，骨髓含有造血干細胞（hemopoietic stem cells， HSCs）、內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells， EPCs）和間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）等多種成體干細胞。EPCs主要分化為血管內(nèi)皮細胞，有助于血管疾病組織的血管新生；而HSCs和MSCs均具有多向分化潛力的特點，研究表明，骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BMMSCs）可分化為成骨、軟骨、心肌、肌腱、上皮、內(nèi)皮等幾乎所有三胚層類型細胞的能力[1-3]，基于這個特性使BMMSCs成為了中藥誘導(dǎo)、臨床移植及一些分子生物學(xué)實驗的種子細胞源。因此，本實驗采用最簡單普通貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)大鼠BMMSCs，若能得到較為純凈BMMSCs，在節(jié)約了培養(yǎng)BMMSCs成本基礎(chǔ)上，提供了一種既簡單又能穩(wěn)定獲得純凈BMMSCs的方法，為相關(guān)的實驗提供豐富的BMMSCs。

1 材料和方法

時間及地點：于2009-09/2011-02在遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院貴州省細胞工程重點實驗室完成。材料：清潔級SD大鼠，購自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動物實驗中心[許可證號：SCXK（渝）2007-0005]。本研究所采用的動物實驗操作程序經(jīng)遵義醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會審議批準。主要試劑：LG-DMEM ，Gibco（New York，USA）

實驗方法：

大鼠BMMSCs的分離、培養(yǎng)：頸椎脫臼法處死2～3周齡SD大鼠，無菌條件下手術(shù)取下兩側(cè)完整股骨（連同肌肉），浸入0.1%新吉爾滅15 min；剝離股骨附著肌肉，并用含雙抗的D-PBS反復(fù)清洗。剪開股骨兩端，用D-PBS沖洗骨髓腔，收集含骨髓細胞的洗脫液，1000 g離心5 min，棄上清，細胞沉淀用含10% FBS的LG-DMEM培養(yǎng)基重懸浮，每只大鼠分離的骨髓細胞接種兩個T25培養(yǎng)瓶，置37 °C、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每2 d換液1次，同時洗脫未貼壁的血細胞，倒置相差顯微鏡下每日觀察細胞生長情況并照相。當(dāng)BMMSCs生長匯合度達60～70 %時，采用0.125%胰蛋白酶消化法，按2～5×105個/ml細胞密度進行傳代培養(yǎng)。

篇8

研究結(jié)果發(fā)表在《組織工程》雜志中，文章詳細闡述了帝國學(xué)院研究小組將胚胎干細胞變成軟骨細胞的過程。這樣，醫(yī)生將可培養(yǎng)軟骨細胞并將其移植到許多受損或患病的組織中，即使因運動產(chǎn)生的損傷也可用新的軟骨取而代之，甚至是進行整容手術(shù)。

軟骨（Cartilage）是骨間非常密集的結(jié)締組織，允許關(guān)節(jié)之間進行平滑的移動。

文章的第一作者Archana Vats博士說：“利用干細胞培養(yǎng)軟骨的技術(shù)在臨床研究中具有巨大的應(yīng)用價值。目前英國的老齡化問題越來越嚴重，長壽不可避免地成為備受關(guān)注的話題。在此之前，醫(yī)生也能進行關(guān)節(jié)移植，卻不能移植軟骨。而更換軟骨后就可以避免再對關(guān)節(jié)進行移植?！?/p>

研究人員在特定系統(tǒng)實驗室的有蓋培養(yǎng)皿中培養(yǎng)人類胚胎干細胞，進而促使其變成軟骨細胞。與生長中的胚胎干細胞相比，在干細胞與軟骨的混合物中存在較高含量的膠原質(zhì)和軟骨蛋白。

篇9

[中圖分類號] R329 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2011）27-10-03

Studies on Specifity Detection of Transdifferentiation of Epidermal Stem Cell to Conjunctival Epithelium

MENG Fanjian1CHEN Jiaqi2

1.Guangzhou Red Cross Hospital，Guangzhou 510220, China；2.Zhongshan Ophthalmic Center, SUN Yat-sen University, Guangzhou 510060，China

[Abstract] Objective To detect the transdifferentiation epidermal stem cells using realtime RT-PCR, and to ensure the feasibility of stem cell treatment on ocular reconstruction. Methods The experimental group cells were co-cultured with the conjunctival epithelial cells as the feeder cells with setting the blank control group. The both groups were cultured for the same time, and after 1, 3, 5, 7 day（s） extracted the RNA and detected the expression of genes beta-2-microglobulin and keratin 13 by real-time RT-PCR method. Results Since the third day there were expression of genes beta-2-microglobulin and keratin 13 in the experimental group, and on the fifth and seventh day the expression increased significantly（P＜0.01）. Conclusion The transdifferentiation epidermal stem cells in this study possessed the same biological characteristics as the normal conjunctival epithelium.

[Key words] Epidermal stem cell; Conjunctival epithelium; Real-time RT-PCR

表皮干細胞為皮膚組織中的專能干細胞，是一種成年組織干細胞[1]，可增殖分化為表皮中各種細胞成分，保持皮膚正常的表皮結(jié)構(gòu)。表皮干細胞的分化方式有兩種：對稱分裂和不對稱分裂。前者分裂成兩個和母細胞相同的子代干細胞；而后者則分裂成一個子代干細胞和一個與母細胞不同的短暫擴增細胞（TAC）[2]，TAC屬定向祖細胞。近年來干細胞療法已成為治療多種疾病的新途徑，可替代、修復(fù)、加強受損的組織或器官的功能[3]。本研究應(yīng)用組織工程學(xué)技術(shù)將表皮干細胞體外定向誘導(dǎo)分化為結(jié)膜上皮細胞，通過對目的細胞生物特性的檢測，探討其在臨床眼表結(jié)膜重建治療中的應(yīng)用前景。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1人皮膚材料包皮標本來自中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科包皮環(huán)切術(shù)患者，無泌尿系統(tǒng)疾病感染，患者年齡18～30歲，所取包皮標本均得到患者知情同意。

1.1.2結(jié)膜組織取自尸體眼正常結(jié)膜組織。

1.1.3試劑和儀器PCR用Taq酶采用TaKaRa公司的Ex-Taq；熒光定量試劑盒：SYBR（R） premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）購自TaKaRa公司（美國）；TRIZOL® Reagent RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司（美國）；RNA提取反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒購自Promega公司（美國）；RoboCycler®Gradient Temperature Cycler PCR儀（Stratagene公司，美國）；MJ Research OpticonTM4熒光定量PCR儀（美國）。

1.2方法

1.2.1飼養(yǎng)細胞的培養(yǎng)取尸體眼結(jié)膜，用加有1×103U/mL青霉素不含鈣鎂的PBS緩沖液沖洗3遍，于無菌超凈臺剪除結(jié)膜下筋膜組織，將其上皮面向上平鋪于無菌培養(yǎng)皿中，加0.25% Dispase Ⅱ，置于37℃消化2h，棄去消化液并用無菌虹膜恢復(fù)器刮取上皮組織，并加入0.25%胰酶及0.02% EDTA消化約20min，待倒置顯微鏡下見到上皮細胞充分消化為多個單細胞狀態(tài)時加入上皮細胞培養(yǎng)液中止消化，收集細胞懸浮液，置于離心管內(nèi)，以1500r/min離心5min，獲得消化的結(jié)膜上皮細胞，將其調(diào)整為1×104個/mL，在6孔Transwell培養(yǎng)板insert池中加入1mL結(jié)膜上皮細胞懸液飼養(yǎng)細胞組為實驗組，對照組insert池中無飼養(yǎng)細胞，僅為相同體積的上皮細胞培養(yǎng)液。

1.2.2表皮干細胞的分離、篩選、培養(yǎng)取無菌手術(shù)獲得的包皮皮片，用加有1×103U/mL青霉素不含鈣鎂的PBS緩沖液沖洗3遍后用含有1×103U/mL青霉素、2.5mg/L兩性霉素不含鈣鎂的PBS緩沖液浸泡30min，無菌超凈臺剪除皮下組織，并剪成2mm×4mm皮條，浸泡于0.25% Dispase Ⅱ，置于4℃過夜。次日用眼科鑷撕取表皮皮片，D-Hank’s液沖洗3次，并用眼科顯微剪將其剪成1mm×1mm碎片，加入0.25%胰酶，37℃消化5～10min，用滴管吹打使細胞脫落，加入上皮細胞培養(yǎng)液中止消化，200目細胞篩過濾得細胞懸液，收集細胞懸浮液置于離心管內(nèi)，以1500r/min離心5min，獲得消化所得的皮膚上皮細胞。將其以1×106個/mL密度接種于Ⅳ型膠原（100μg/mL）鋪底的培養(yǎng)瓶置于5% CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱中待細胞貼壁20min后，去除未貼壁細胞，加入新的上皮細胞培養(yǎng)液，5% CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，1～2d換液一次。

1.2.3表皮干細胞與結(jié)膜上皮細胞共培養(yǎng)的誘導(dǎo)分化取1～2代表皮干細胞作為實驗細胞，以5×106個/mL接種于6孔Transwell培養(yǎng)板中，實驗組insert池中加入1mL結(jié)膜上皮細胞（細胞濃度為1×104個/mL）作為飼養(yǎng)細胞；對照組insert池中僅為相同體積的上皮細胞培養(yǎng)液，5% CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1、3、5、7d后，棄細胞培養(yǎng)液，分別取對照組和實驗組細胞提取RNA，進行實時定量RT-PCR檢測目的基因β2-微球蛋白、角蛋白K13的表達情況。

1.2.4細胞總RNA的提取吸出6孔Transwell培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，每孔加入1mL TRIZOL® Reagent，振蕩混勻，15～30℃溫育5min，每1mL Trizol加入0.2mL氯仿，振蕩15s，然后于15～30℃放置2～3min，于2～8℃離心樣品15min（＜12 000g），將上層水相移至新管中，每1mL原始Trizol用量加入0.5mL異丙醇，室溫放置10min，4℃離心（＜12 000g），棄上清，每1mL Trizol用量用1mL 75%乙醇洗滌，振蕩樣品，然后7 500g離心樣品5min（如果用來富集小分子RNA，則不用75%乙醇洗滌，直接進入下一步），空氣干燥RNA 10min，用適量RNase free水溶解，于60℃溫育10min，置于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5引物的構(gòu)建按照參考文獻[4]構(gòu)建設(shè)計：β-actin正向引物：5’-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3’，β-actin反向引物：5’-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3’；β2M正向引物：5’-GAATTGCTATGTGTCTGGGT-3’，β2M反向引物：5’-CATCTTCAAACCTCCATGATG-3’；CK13正向引物：5’-GAGGAATGGTTCCACGCCAAG-3’，CK13反向引物：5’-GCGACCAGAGGCATTAGAGGT-3’。

1.2.6PCR擴增取3μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物做模板，根據(jù)試驗?zāi)康募尤胂鄳?yīng)的正向引物和反向引物。PCR反應(yīng)總體系為20μL。條件為95℃ 5min，1個循環(huán)；94℃ 30s，57℃ 40s，72℃ 40s，共30個循環(huán)；72℃ 10min，1個循環(huán)。

1.2.7熒光定量PCR按照SYBR（R）Premix Ex TaqTM試劑盒的說明書進行。取1μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物做模板，20μL反應(yīng)體系，引物濃度為10nM/μL，各加入0.5μL。SYBR（R）Premix Ex TaqTM 10μL，用雙蒸水補平至20μL。反應(yīng)程序為94℃ 10s，1個循環(huán)；94℃ 5s，58℃ 31s，讀板，40個循環(huán)。數(shù)據(jù)分析采用2-CT方法。

2結(jié)果

Realtime RT-PCR的結(jié)果見圖1、圖2。結(jié)果可見實驗組表皮干細胞5d及7d后β2-微球蛋白mRNA的表達明顯上調(diào)，分別為（300±26）%（P＜0.01）、（300±13）%（P＜0.01）；CK13 mRNA表達上調(diào)（480±110）%（P＜0.01）、（760±53）%（P＜0.01）。與對照組相比，β2-微球蛋白mRNA及CK13 mRNA表達都有顯著性上調(diào)。

圖1表皮干細胞中β2-微球蛋白mRNA的表達水平5d實驗組細胞中β2-微球蛋白mRNA表達上調(diào)（300±26）%（P＜0.01）；7d實驗組細胞中β2-微球蛋白mRNA表達上調(diào)（300±13）%（P＜0.01），其中n=5，6

圖2表皮干細胞中CK13 mRNA的表達水平5d實驗組細胞中CK13 mRNA表達上調(diào)（480±110）%（P＜0.01）；7d實驗組細胞中CK13 mRNA表達上調(diào)（760±53）%（P＜0.01），其中n=5，6

3討論

角蛋白（keratin）是上皮細胞異性的中間絲成分。已知的細胞中表達的各種角蛋白家族亞單位成員具有組織特異性，并且和細胞的分化相關(guān)[5]。例如：Krenzer等[6]報道：在正常結(jié)膜上皮細胞中表達角蛋白K13/K4/K8/K19/K7。Dota等[7]研究報道：通過對38例正常結(jié)膜組織的上皮細胞建立的cDNA文庫，檢測出角蛋白K13是結(jié)膜細胞轉(zhuǎn)錄中表達最豐富的基因，且該基因與細胞骨架的合成有關(guān)，并認為K13有可能是有關(guān)眼表結(jié)膜細胞分化最敏感的基因。而且早期的研究中也證明：在結(jié)膜上皮細胞的免疫組化鑒定中結(jié)膜上皮細胞可被特異性角蛋白K13抗體標記，而在皮膚干細胞中并無相應(yīng)抗體的表達[8]。

β2-微球蛋白（beta-2-microglobulin）是HLA抗原的成分之一。雖然有關(guān)該種蛋白的功能尚未明確，但是該蛋白存在于淚液中并可能來源于結(jié)膜上皮細胞中。并且在正常狀態(tài)下淚液中的β2-微球蛋白濃度明顯高于炎癥時淚液中濃度。Dota等[7]研究中也同時檢測到β2-微球蛋白也是結(jié)膜上皮細胞轉(zhuǎn)錄較高的基因，因此本研究將CK13和β2-微球蛋白作為結(jié)膜上皮細胞標記性（特異性）的高效表達基因。

近年來，相關(guān)文獻[9-11]報告了通過組織工程技術(shù)將成體干細胞體外合成生物替代品，并對其組織功能改良用于眼表重建的臨床治療新技術(shù)。然而，成功的眼表重建依賴于兩個重要因素。其一，具有高分化、高增殖能力的干細胞；其二，干細胞的載體組織。本研究中應(yīng)用具有高分化、高增殖能力的表皮干細胞為種子細胞，從而保證眼表重建治療中能獲得可靠的細胞源。我們早期的相關(guān)研究中[4]報告應(yīng)用同源異體的結(jié)膜去細胞基質(zhì)膜為干細胞載體膜，不僅可保證具有良好的組織相容性，而且也確保在體外模擬形成結(jié)膜上皮細胞增殖的組織微環(huán)境。從而誘導(dǎo)表皮干細胞定向分化、增殖。

研究結(jié)果顯示經(jīng)誘導(dǎo)分化的表皮干細胞在短時間內(nèi)具有結(jié)膜上皮細胞的特異性基因CK13及β2-微球蛋白的高表達，提示該實驗方法可誘導(dǎo)表皮干細胞形成特異性短暫擴增細胞（TAC），并能定向分化為類結(jié)膜上皮細胞。因此，在臨床上眼表重建的干細胞療法應(yīng)用中，該方法不僅可保證獲得充足的目的細胞來源，而且確保目的細胞具有穩(wěn)定的生物學(xué)特性。在眼表結(jié)膜組織的重建及生理功能恢復(fù)的臨床治療中提供有效的組織來源。但是，該研究方法中誘導(dǎo)分化的表皮干細胞作為種子細胞能否合成人工結(jié)膜生物膜活體動物眼表的存活狀況及生理功能重塑方面的問題，還需要進一步的研究探索。

[參考文獻]

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[2] Finlan LE，Hupp TR. Epidermal stem cells and cancer stem cells: insights into cancer and potential therapeutic strategies[J]. Eur J Cancer，2006，42（9）：1283-1292.

[3] Hofmann S，Hagenmuller H，Koch AM，et al. Control of in vitro tissue-engineered bone-like structures using human mesenchymal stem cells and porous silk scaffolds[J]. Biomaterials，2007，28（6）：1152-1162.

[4] 孟繁劍，陳家祺. 人皮膚干細胞體外誘導(dǎo)分化構(gòu)建人工結(jié)膜的實驗[J]. 中山大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)科學(xué)版），2006，27（3）：246-249.

[5] Adams JC，Watt FM. Regulation of development and differentiation by the extracellular matrix[J]. Development，1993，117（4）：1183-1198.

[6] Krenzer KL，F(xiàn)reddo TF. Cytokeratin expression in normal human bulbar conjunctiva obtained by impression cytology[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci，1997，38（1）：142-152.

[7] Dota A，Nishida K，Adachi W，et al. An expression profile of active genes in human conjunctival epithelium[J]. Exp Eye Res，2001，72（3）：235-241.

[8] Moll R，F(xiàn)ranke WW，Schiller DL，et al. The catalog of human cytokeratins: patterns of expression in normal epithelia, tumors and cultured cells[J]. Cell，1982，31（1）：11-24.

[9] Rama P，Bonini S，Lambiase A，et al. Autologous fibrin-cultured limbal stem cells permanently restore the corneal surface of patients with total limbal stem cell deficiency[J]. Transplantation，2001，72（9）：1478-1485.

篇10

0 引言

目前，臨床上普遍使用造血干細胞移植，用于白血病、非霍奇金淋巴瘤、地中海貧血等病的治療。造血干細胞的主要來源是臍帶血、骨髓。如果直接進行骨髓移植，則需要進行人體的白細胞抗原配型，否則發(fā)生免疫排異會危及患者生命。現(xiàn)有臍帶血庫儲存的造血干細胞免疫原性弱，但數(shù)量供不應(yīng)求，使其在疾病中的臨床應(yīng)用中受到限制。隨著誘導(dǎo)性多能干細胞（IPS）提取技術(shù)的出現(xiàn)，使分化自身細胞變?yōu)榱爽F(xiàn)實，不但避免了倫理問題，解決了免疫排斥問題，造血干細胞的數(shù)量也能滿足臨床需求。下面將分化研究過程報道如下：

1 材料和方法

1.1細胞株的來源

小鼠骨髓基質(zhì)細胞OP9購于美國ATCC，誘導(dǎo)性多能干細胞IPS由中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院提供。

1.2試劑和儀器

小鼠骨髓基質(zhì)細胞OP9的培養(yǎng)基為α-MEM，內(nèi)含20%的胎牛血清，OP9細胞誘導(dǎo)干細胞分化培養(yǎng)基為α-MEM（15%的DFBS、0.25%胰酶、0.1%明膠），CD34來自MACS公司。抗體為APS-TRA-1-85，半固體培養(yǎng)基購于SCT公司。流式細胞儀為美國AccuriC6型，定量PCR儀為CFX96型。

1.3方法

在六孔板中先鋪好1%的metrigel進行細胞培養(yǎng)，每三天添加0.5mmol/L的EDTA，以保持對照組細胞的未分化狀態(tài)，OP9用細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)時放在大小為10cm且鋪有0.1%的明膠的盤里，，每隔四天用胰酶消化傳代。細胞培養(yǎng)溫度為37℃，CO2濃度為0.5，濕度飽和。

OP9細胞進行傳代培養(yǎng)4天后，將OP9的培養(yǎng)液換成誘導(dǎo)干細胞分化的培養(yǎng)液，將UC013細胞洗兩遍后，再對邊緣部位細胞進行消化，將細胞吸出后加入Dispace，再用槍頭吹吸混勻細胞后，將其轉(zhuǎn)移到加有分化培養(yǎng)液的細胞盤中搖勻，在與上述培養(yǎng)的溫度、空氣CO2濃度和濕度相同的條件下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)的第二天將培養(yǎng)液換為共培養(yǎng)液，第四天開始每隔一天半換一次培養(yǎng)液，第九天收樣品。

免疫磁珠法分選CD34+細胞，將細胞用PBS洗兩遍，接著用胰蛋白酶進行消化，制備單細胞懸液，再將細胞收集到離心管中進行離心，收集沉淀，再向其中加入2%血清吹打均勻。過濾后，向其中加入FCR和 CD34標記細胞，30秒后加入流式細胞緩沖液，再離心，然后吸取上清，加入流式細胞緩沖液重懸。將制備好的細胞懸液加入流式細胞儀進行分離，通過流式細胞儀分離柱的CD34-細胞被移出分離柱棄之，最終，通過加壓洗脫分離柱上黏附的細胞，即得到CD34+細胞。

用流式細胞術(shù)進行檢測，將共培養(yǎng)9天后的細胞用PBS清洗、胰蛋白酶消化后，制備單細胞懸液，收集到離心管中，靜置五秒后，用加有2%血清的流式緩沖液重懸，細胞過濾后，加入FCR和抗體，孵育15min，再用流式緩沖液清洗，重懸，最后用流式細胞儀進行檢測。

集落形成實驗。將分選的CD34+細胞接種到半固體培養(yǎng)基中，放于培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)，每孔接種1萬個細胞，培養(yǎng)14-16天。然后，在顯微鏡下根據(jù)集落成的血細胞形成特征，對集落細胞進行分類和計數(shù)。同時，提取共培養(yǎng)2、4、6、8、10和12天的細胞的RNA，用RT-PCR法檢測各基因在細胞中的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1細胞培養(yǎng)與觀察

觀察培養(yǎng)的細胞，結(jié)果顯示，對照組未分化的人體細胞集落狀生長，呈扁平狀，排列緊密，沒有分化的跡象。實驗組培養(yǎng)2天后的細胞，表面布滿細胞集落，已進行造血干細胞分化。OP9細胞貼著細胞壁生長，細胞為三角形，周圍向外出伸出像纖維狀的偽足，細胞排列規(guī)則，生長迅速，培養(yǎng)4天后細胞鋪滿了培養(yǎng)皿底。

2.2誘導(dǎo)造血干細胞分化

通過在本實驗組的誘導(dǎo)分化條件下，對實驗組和對照組細胞的培養(yǎng)，實驗組細胞分化到一定程度后，便開始大量克隆，細胞的形態(tài)也發(fā)生了分化，接著，OP9細胞開始出現(xiàn)老化跡象。

2.3流式細胞術(shù)檢測

共培養(yǎng)9天后用流式細胞儀檢測細胞造血表面標志物表達情況，用流式細胞儀分析培養(yǎng)細胞的CD34、CD43、CD31的表達情況，結(jié)果顯示表達上述表面標志物的細胞分別占有比例為20%、2%和7.1%。

2.4 4RT-PCR檢測

運用RT-PCR對共培養(yǎng)的細胞進行基因表達檢測，結(jié)果顯示，IPS細胞發(fā)生造血分化時，Oct-4基因的表達慢慢消失；造血轉(zhuǎn)錄因子基因表達緩慢升高；Runx-1基因在造血干細胞分化12天當(dāng)中的表達呈波浪式變化，其中分化第二天表達量最高，第四天開始下降，第八天開始升高；CD34在造血分化過程中的基因表達量逐漸增高。

2.5 CD34+細胞集落實驗

CD34+細胞在半固體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，根據(jù)造血干細胞的形態(tài)特征，對細胞集落進行分類和計數(shù)。結(jié)果顯示，紅系集落（CFU-E）、粒系集落（CFU-G）、巨核系集落（CFU-M）、粒―巨核系集落（CFU-GM）集落數(shù)量持續(xù)升高，混合系集落（CFU-GEMM）的集落數(shù)量逐漸降至最低。

3 討論

隨著干細胞技術(shù)的發(fā)展，通過誘導(dǎo)分化得到造血干細胞已經(jīng)成為事實。相對于多能干細胞而言，IPS通過導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄因子以及重編程進行定向分化的比例較低，，但是IPS的獲得方法比較簡單穩(wěn)定，避免了胚胎干細胞面臨的倫理和法律等問題，使IPS可以應(yīng)用于細胞替代性治療，并可以進行疾病的機理研究和腫瘤治療藥物的篩選。IPS細胞分化得到的造血干細胞免疫原性較低，解決了移植排斥的問題。

在本文的研究中，沒有外加細胞因子，直接將IPS細胞誘導(dǎo)分化為造血干細胞，結(jié)果獲得了20%的CD34+細胞，即造血干細胞，CD34是表達于造血干細胞的表面標志物，表明IPS可以分化為造血干細胞，但是轉(zhuǎn)化率比較低。Runx1是調(diào)控造血干細胞分化的轉(zhuǎn)錄因子，期基因的表達量在分化過程中呈現(xiàn)波浪式的變化，Gata-2的表達則逐漸升高。體外分化得到的造血干細胞在半固體培養(yǎng)基中成集落狀態(tài)，說明IPS可以向各細胞系進行分化。

現(xiàn)在多能干細胞分化為造血干細胞的方法主要有：一是形成胚狀體后再進行誘導(dǎo)生成造血干細胞；二是基質(zhì)細胞與多能干細胞共培養(yǎng)；三是形成EB后與OP9進行共培養(yǎng)；四是單層誘導(dǎo)ESC生成造血干細胞。利用OP9細胞與胚胎干細胞共培養(yǎng)，可以模擬體內(nèi)的造血微環(huán)境，為研究細胞定向分化為造血干細胞創(chuàng)造了可能性，OP9細胞主要支持早期的造血干細胞分化，并協(xié)助B淋巴細胞增殖?；|(zhì)細胞通過釋放的細胞因子支持造血干細胞的分化。這種誘導(dǎo)方法分化時間短，為臨床造血干細胞的移植提供了便利。誘導(dǎo)分化過程中不用添加細胞因子，比較經(jīng)濟。但該誘導(dǎo)方法也存在著一定的缺點，即存在鼠源性污染細胞的可能性，加之所用血清的成分的不明確性，限制了其在臨床應(yīng)用。

目前臨床上移植造血干細胞主要是用臍血和骨髓來源的造血干細胞，而體外分化和擴增得到造血干細胞只能通過動物試驗來獲得。將造血干細胞植入重建小鼠體內(nèi)，可以評價造血干細胞的功能。體外分化獲得的造血干細胞和臍血中的造血干細胞與重建小鼠體內(nèi)造血系統(tǒng)差異較大，需要進一步優(yōu)化體外誘導(dǎo)多能干細胞分化為造血干細胞的過程，才能滿足該實驗需求

4 小結(jié)

通過將IPS定向分化為造血干細胞的研究，成功誘導(dǎo)了造血干細胞，分化得到的細胞在體外培養(yǎng)中形成了所需的各系集落，本文的研究所采用的技術(shù)方法希望可以為IPS細胞在造血疾病中的應(yīng)用提供一定的實驗依據(jù)。

參考文獻：