導(dǎo)言：作為寫作愛好者，不可錯過為您精心挑選的10篇基因治療的基本策略，它們將為您的寫作提供全新的視角，我們衷心期待您的閱讀，并希望這些內(nèi)容能為您提供靈感和參考。

篇1

目前我國基本醫(yī)療保險已經(jīng)覆蓋12.95億人，覆蓋95%以上人口。隨著我國醫(yī)療衛(wèi)生體制的改革，覆蓋面已經(jīng)基本涵蓋了城鎮(zhèn)居民、農(nóng)民及外出打工人群。人們在享受醫(yī)療保險帶給我們醫(yī)療保障的同時，醫(yī)療費(fèi)用的快速上漲，也給醫(yī)?；饚砹顺林氐呢?fù)擔(dān)。因此，若何有效控制醫(yī)療保險費(fèi)用的過快增長，是醫(yī)療保險制度健康、有序、穩(wěn)步發(fā)展的前提，是保障人民群眾健康的物質(zhì)基礎(chǔ)，同時，也是醫(yī)療保險事業(yè)平穩(wěn)運(yùn)行的基石。本文結(jié)合醫(yī)療保險管理的實(shí)際，對我國醫(yī)療保險運(yùn)行機(jī)構(gòu)如何控制醫(yī)療保險費(fèi)用的過快增長進(jìn)行分析和探討。

一、醫(yī)療費(fèi)用過快增長的原因分析

引起次均醫(yī)療費(fèi)用和就醫(yī)頻率增加的因素很多，從對部分省份醫(yī)療基金運(yùn)行的實(shí)際情況分析，主要影響因素包括以下方面：

（一）正常醫(yī)療需求的增加。

一方面，基本醫(yī)療保險制度從無到有，居民生活水平不斷提高，使人們的醫(yī)療需求得以正常釋放，直接影響到了就醫(yī)頻率的增加。同時，2009年開始，各統(tǒng)籌地區(qū)為了合理控制醫(yī)療保險統(tǒng)籌基金的結(jié)余規(guī)模，分階段、不同程度地對本統(tǒng)籌地區(qū)醫(yī)療保險待遇政策進(jìn)行了調(diào)整。例如：提高醫(yī)療保險統(tǒng)籌基金年度最高支付限額和共付段醫(yī)?；鹬Ц侗壤?、增設(shè)門診大病病種等。在降低參保人員個人負(fù)擔(dān)的同時，提升了參保人員的就醫(yī)意愿，從而影響到了就醫(yī)頻率的增加。

另一方面，我國城鎮(zhèn)職工參保人群年齡結(jié)構(gòu)處于一個逐漸老化的趨勢中，各種慢性疾病、危重病發(fā)生概率增加，直接導(dǎo)致就醫(yī)頻率和次均費(fèi)用的增加。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，退休人員的次均門診費(fèi)用與在職人員差別不大，次均住院費(fèi)用、門診就診率和住院率卻差別明顯。

（二）以量補(bǔ)價的過度醫(yī)療現(xiàn)象普遍存在，推動醫(yī)療費(fèi)用大幅增加。

受國家價格政策因素的影響，醫(yī)療機(jī)構(gòu)通過提高醫(yī)療收費(fèi)項(xiàng)目價格的創(chuàng)收途徑受到制約，同時又由于我國絕大部分統(tǒng)籌地區(qū)均采用項(xiàng)目付費(fèi)的結(jié)算方式，刺激了各醫(yī)療機(jī)構(gòu)通過增加醫(yī)療服務(wù)提供量和種類來創(chuàng)收。以量補(bǔ)價的過度醫(yī)療情況已成為我國醫(yī)療費(fèi)用不合理支出快速增加的重要原因。

（三）先進(jìn)醫(yī)療技術(shù)在臨床推廣，對高級別醫(yī)院的次均費(fèi)用影響較大。

隨著科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，新的醫(yī)療儀器設(shè)備、藥品和診療技術(shù)層出不窮，極大地提高了診療水平，在解決疑難雜癥方面起到了重要作用。與此同時，醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，其本身的高科技價值也帶來了醫(yī)療費(fèi)用的攀升。

二、控制醫(yī)療費(fèi)用上漲的應(yīng)對措施

醫(yī)療衛(wèi)生資源的有限性與醫(yī)療服務(wù)需求的不斷膨脹之間的矛盾，醫(yī)療保險籌資與支出之間的矛盾，醫(yī)療保險支出與積累之間的矛盾，是關(guān)系到社會保險事業(yè)持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。根據(jù)醫(yī)療費(fèi)用上漲的特點(diǎn)，在保障醫(yī)療需求合理增加的前提下，結(jié)合電力行業(yè)實(shí)際，應(yīng)從以下幾方面采取措施，控制醫(yī)療費(fèi)用的快速上漲。

（一）加大醫(yī)保政策宣傳力度。

我國現(xiàn)行的是“低水平、廣覆蓋、保基本”的醫(yī)療保障制度和“以收定支、收支平衡、略有結(jié)余”的基金管理原則。醫(yī)保部門應(yīng)加強(qiáng)醫(yī)保政策的宣傳，使參保人員明白基本醫(yī)療保險保的是基本醫(yī)療，而不是特需醫(yī)療?；踞t(yī)療就是因病施治，進(jìn)行合理的檢查、用藥及治療。不根據(jù)病情需要，盲目要求醫(yī)生多開藥、開貴藥，不僅不能對癥治療，還會給自己和醫(yī)?；鹪斐衫速M(fèi)。

（二）加強(qiáng)政策引導(dǎo)，合理分流病人。

建立雙向轉(zhuǎn)診制度，合理分流參保人員到適合自身疾病治療的相應(yīng)級別醫(yī)院就醫(yī)。為促使雙向就診制度的有效實(shí)施，醫(yī)療保險經(jīng)辦機(jī)構(gòu)應(yīng)積極主動延伸服務(wù)，一方面將各定點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)收治的各類常見病的治愈率、次均醫(yī)療費(fèi)用、平均住院天數(shù)、個人負(fù)擔(dān)、病人滿意度等多種信息定期對外公布；另一方面，對我國醫(yī)技高超、醫(yī)德高尚的醫(yī)務(wù)工作者，醫(yī)療保險經(jīng)辦機(jī)構(gòu)可以主動進(jìn)行宣傳，盡量減少病人和醫(yī)院之間的信息不對稱程度。

（三）實(shí)施醫(yī)療保險定點(diǎn)醫(yī)生管理制度，強(qiáng)化醫(yī)務(wù)人員的自律性。

隨著我國五險合一的金保工程二期信息系統(tǒng)在部分地區(qū)范圍內(nèi)逐步推廣使用，對醫(yī)療保險定點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)精確化管理程度提高，管理落實(shí)到醫(yī)生的條件已基本成熟?？梢越⒉糠值貐^(qū)醫(yī)療保險定點(diǎn)醫(yī)生庫，制定定點(diǎn)醫(yī)生誠信評判標(biāo)準(zhǔn)和激勵機(jī)制，建議全國各省份人力資源和社會保障管理部門將醫(yī)保定點(diǎn)醫(yī)生的誠信狀況作為醫(yī)生職稱評定的標(biāo)準(zhǔn)之一，提升醫(yī)生提供醫(yī)療服務(wù)的自律性。

（四）加強(qiáng)醫(yī)?；斯芾?，確?；鸢踩?/p>

加強(qiáng)醫(yī)保稽核管理，加大對違規(guī)行為的查處力度，對參保人員將醫(yī)療卡、證轉(zhuǎn)借他人使用，惡意騙取醫(yī)?；鸬雀鞣N違規(guī)行為，要加大查處打擊力度，以此強(qiáng)化就醫(yī)管理，促使參保人員規(guī)范就醫(yī)行為。如：把醫(yī)?；俗鳛獒t(yī)保工作重心之一，通過加強(qiáng)對監(jiān)管，有效遏制分解住院、降低入院標(biāo)準(zhǔn)、掛床、冒名住院、虛擬住院、過度治療等不規(guī)范醫(yī)療服務(wù)行為，促進(jìn)醫(yī)療服務(wù)質(zhì)量的提高，維護(hù)參保人的權(quán)益。

（五）完善醫(yī)療保險定點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)管理質(zhì)量評價機(jī)制，實(shí)施定點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)分級管理。

篇2

【中圖分類號】R341 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1004-7484（2012）13-0013-02

目前，基因治療已成為一種全新的腫瘤治療模式，其中自殺基因治療是一種頗具臨床應(yīng)用潛力的治療策略， 但是由于治療的靶向性成為關(guān)系到治療安全性的瓶頸問題。近年來研究表明[1-5]，超聲微泡造影劑有望成為一種新型的體內(nèi)靶向給藥的載體系統(tǒng)。本研究旨在構(gòu)建超聲微泡包裹的特異性雙自殺基因慢病毒載體，為臨床實(shí)時可視狀態(tài)進(jìn)行超聲定位控釋和載質(zhì)粒微泡基因治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 雙自殺基因慢病毒載體pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK的構(gòu)建與包裝

1.1.1目的基因的擴(kuò)增與TA克隆

提取正常人外周血gDNA，并通過PCR方法擴(kuò)增出KDRP、CD、TK基因；回收

PCR產(chǎn)物并分別將其鏈接到pMD18-T載體上，構(gòu)成重組T質(zhì)粒；抽提質(zhì)粒，并對各重組T質(zhì)粒的酶切鑒定及測序；

1.1.2 慢病毒載體構(gòu)建與包裝鑒定

將經(jīng)測序證實(shí)的T-KDRP、T-CD、T-TK三種質(zhì)粒上的KDRP、CD、TK元件通過特定的限制性內(nèi)切酶酶切后，依次連接到經(jīng)相應(yīng)酶酶切的pLenti6-EGFP載體上，經(jīng)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，24h后通過熒光顯微鏡即可見GFP熒光表達(dá)，72h后收集上清，0.45um濾器過濾，25000rpm離心90min，沉淀溶于Hanks溶液，-80℃貯存?zhèn)溆?。將梯度稀釋的病毒液，加?93T細(xì)胞中，72h后置于熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況，計數(shù)發(fā)熒光細(xì)胞數(shù)目，根據(jù)病毒用量和稀釋度計算滴度。按公式計算病毒滴度：

病毒滴度=GFP細(xì)胞陽性數(shù)×病毒上清稀釋倍數(shù)/0. 4m1（pfu/ml）。

1.2 載藥粒微泡的制備于鑒定

1.2.1載藥粒微泡的制備

聲諾維sonovue為磷脂包裹的六氟化硫（SF6），按使用說明注入生理鹽水5 ml震蕩形成微泡混懸液。取50ul微泡懸液于1.5mlEP管內(nèi)，再滴加入100MOI病毒載量的病毒上清液，輕輕混勻后室溫孵育20 min。

1.2.2載藥粒微泡的鑒定方法。

采用Malvern激光測量儀檢測載藥微泡的粒徑大小，光學(xué)顯微鏡觀察其外觀，采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測定載藥微泡的包封率和載藥量。

（1）粒徑大小比較

載質(zhì)粒微泡為白色混懸液，PBS（Phosphate buffered saline 磷酸鹽緩沖生理鹽水）沖洗，靜置后分三層，上層、中間層為微泡，下層為PBS液。去除上層及下層液，取中層液，測定其粒徑大小，鏡下比較觀察載藥微泡與空白微泡外觀。

（2）包封率的測定

將制備好的含有慢病毒載體的微泡溶液中加入5%乙醇1 mL混勻，6℃，16000 rpm高速離心20min，去上層微泡，取下層液體，加5%乙醇0.5 mL稀釋沖洗，再加入適量乙醚，漩渦振搖，6000 rpm離心15 min，取乙醚層，50℃水浴揮干后，加0.5 mL甲醇溶解作為樣液，進(jìn)樣量10μL。采用RP-HPLC測定雙自殺基因慢病毒載體pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK的包封率，按下式計算包封率：

包封率（%）=[（投入藥量―游離藥量）/投入藥量]×100%

（3）載藥量的測定

以下式計算載藥量：

載藥量%=（Wt～Wi）/Wc×100%

其中Wt為脂質(zhì)微泡溶液中藥物總含量，Wi為游離藥物量，Wc為磷脂用量。

（4）穩(wěn)定性測定

4℃冰箱貯存，對短期內(nèi)的載藥微泡溶液的質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測。

取少量載藥微泡混懸液分別于1d、2d、5d、8d、10 d經(jīng)光學(xué)顯微鏡（×400）進(jìn)行觀察其形態(tài)變化。第10 d的取該樣品由Malvern粒徑測量儀檢測粒徑。4℃冰箱貯存10 d后，RP-HPLC測定載藥微泡溶液的包封率。

2 結(jié)果

2.1 病毒滴度檢測結(jié)果：

經(jīng)熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況，計數(shù)發(fā)熒光細(xì)胞數(shù)目，根據(jù)病毒用量和稀釋度，獲得病毒滴度為（3.5×1012pfu/L）的雙自殺基因慢病毒載體pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK。

2.2 載藥微泡質(zhì)量鑒定：

2.2.1包裹有pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK的聲諾維微泡與空白聲諾維微泡粒徑的對比觀察：

載質(zhì)粒微泡呈乳白色混懸液，用磷酸鹽緩沖生理鹽水（Phosphate buffered saline PBS）沖洗，靜置后分三層，上層、中間層為微泡，下層為PBS液。

鏡下比較觀察載質(zhì)粒微泡（圖A）與空白微泡（圖B）的形態(tài)，其形態(tài)相近，為近似的圓形微泡。其粒徑范圍92%在2～5μm之間，平均粒徑約2.90μm（圖A），粒徑大小均相似。

2.2.2 包封率和載藥量測定結(jié)果

采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測定載藥微泡的包封率和載藥量，

得到結(jié)果：

包封率為90.6±3.1%。載藥量為29.2±0.9%。

2.2.3 穩(wěn)定性測定：

4℃冰箱貯存10 d后，可見仍為乳白色混懸液，光鏡下觀察，微泡粒徑大小未見明顯變化，微泡形態(tài)好，大小均勻，相互之間無明顯聚集現(xiàn)象，分層情況基本同前，樣品經(jīng)光鏡下觀察及Malvern測量儀檢測發(fā)現(xiàn)，與制備初始相比，平均粒徑大小約3.08μm），未見明顯變化；RP-HPLC測得包封率：86.1±2.8%，沒有出現(xiàn)明顯藥物滲漏。

3 討論

基因治療已成為一種全新的腫瘤治療模式，其中自殺基因治療是近年來新興的腫瘤基因治療的研究熱點(diǎn)。自殺基因療法是利用基因工程技術(shù)將自殺基因轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，注入體內(nèi)的無毒或低毒的前藥在表達(dá)的特異性酶作用下轉(zhuǎn)化成毒性產(chǎn)物，該產(chǎn)物可作為DNA合成的核苷替代物摻入到DNA中，干擾細(xì)胞DNA的合成，從而引起腫瘤細(xì)胞的死亡[6]。

本研究所采用的克隆方法并不是將PCR產(chǎn)物直接與表達(dá)載體相連接，而是先將PCR產(chǎn)物TA克隆，構(gòu)建成重組T質(zhì)粒后再將目的基因與表達(dá)載體酶切連接，主要是考慮到：PCR產(chǎn)物直接進(jìn)表達(dá)載體成功率不高；而先進(jìn)T載體，再酶切連接表達(dá)載體，可減少堿基錯配，提高成功率。目前己發(fā)現(xiàn)的自殺基因體系已有十多種，本實(shí)驗(yàn)選擇胞嚓陡脫氨基酶基因（CD）和單純疤疹病毒胸普激酶基因 （HsV-TK簡稱TK）來構(gòu)建雙自殺基因質(zhì)粒，是因?yàn)檠芯勘砻鱗7]，二者作用機(jī)制具有很強(qiáng)的互補(bǔ)性，將其連接在一起，構(gòu)成融合基因，使兩個自殺基因體系協(xié)同作用，能顯著增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。同時選用腫瘤特異性啟動子KDRP，突破對腫瘤細(xì)胞類型的依賴性，擴(kuò)大腫瘤基因治療譜。運(yùn)用增強(qiáng)型GFP綠色熒光蛋白作為報告基因，可直觀的檢測目的基因的檢測和計算病毒滴度。而慢病毒載體最大的特點(diǎn)是可以感染分裂期及非分裂期細(xì)胞，容納外源性目的基因的片段大，可以在體內(nèi)長期地表達(dá)，不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)，安全性較好，可在更多范圍的宿主細(xì)胞內(nèi)生成高滴度的病毒，己成為當(dāng)前基因治療中載體研究的熱點(diǎn)。

超聲微泡造影劑聲諾維可作為一種新型基因載體。在一定劑量超聲波的輻照下，利用微泡在超聲介導(dǎo)下的空化效應(yīng)介導(dǎo)目的基因的靶向釋放和導(dǎo)入。國內(nèi)外許多學(xué)者通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)空化效應(yīng)是超聲介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的主要機(jī)制，微泡造影劑作為外源性空化核被引入體內(nèi)后大大增加了單位體積內(nèi)空化核的數(shù)量，降低超聲波的空化閉值，增強(qiáng)空化效應(yīng)，從而提高基因轉(zhuǎn)染效率[3-4]，尤其在抗腫瘤治療、溶栓治療等方面具有潛在的重要應(yīng)用價值。經(jīng)靜脈注入載藥微泡后，用超聲輻照特定部位，含氣體的超聲造影劑在超聲波作用下會不斷地產(chǎn)生非對稱性收縮和膨脹，當(dāng)聲能達(dá)到一定強(qiáng)度時，微泡破裂藥物被釋放到超聲所輻照的局部組織中。在這一過程中，微泡作為空化核增強(qiáng)空化效應(yīng)，依靠能量輻射作用，使微泡破壞后釋放的藥物能夠進(jìn)入血管壁甚至組織間隙，從而發(fā)揮定位靶向治療作用[2]。

而載藥微泡的外觀、粒徑大小、包封率、載藥量等是衡量載藥脂質(zhì)微泡質(zhì)量的最重要指標(biāo)。我們制作的載雙自殺基因慢病毒載體微泡乳化良好，大小均勻，粒徑范圍92%在2-5μm，與空白微泡相似。微泡內(nèi)藥物的包封率為90.6±3.1%，載藥量為29.2±0.9%，均達(dá)到較理想的水平。此外穩(wěn)定性也是衡量載藥脂質(zhì)微泡特性的主要指標(biāo)之一，它能反映脂質(zhì)微泡溶液包封率隨時間變化的情況。脂質(zhì)微泡作為藥物載體穩(wěn)定性是指被包裹藥物在脂質(zhì)微泡中的滯留性。經(jīng)由本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，我們制作的載藥微泡同時也具有較高的穩(wěn)定性。

本研究聯(lián)合了雙自殺基因的殺傷效應(yīng)、KDR啟動子的腫瘤特異性、慢病毒載體的高載性和超聲微泡靶向的可控釋性等多種技術(shù)優(yōu)點(diǎn)，制備出了較為理想的載有靶向基因藥物的微泡，期望為進(jìn)一步臨床實(shí)施可視狀態(tài)下的腫瘤的基因治療提供一種更加安全、高效的策略。

參考文獻(xiàn)

[1] van Wamel A，Kooiman K，Harteveld M，et al.Vibrating microbubbles poking individual cells：drug transfer into cells via sonoporation.J Control Release，2007，112（2）：149-155.

[2] Kodama T，Tomita Y，Koshiyama K，et al.Transfection effect of microbubbles on cells in superposed ultrasound waves and behavior of cavitation bubble.UltrasoundMed Biol，2006，32（6）：905-914.

[3] Iwanaga K，Tominaga K，Yamamoto K，et al.Local delivery system of cytotoxic agents to tumors by focused sonoporation.Cancer Gene Ther，2007，14（4）：354-363.

[4] Bekeredjian R，Kuecherer HF，Kroll RD，et al.Ultrasound-targeted microbubble destruction augments protein delivery into testes. Urology，2007，69（2）：386-389.

[5] Kheirolomoom A，Dayton PA，Lum AF，et al.Acoustically-active microbubbles conjugated to liposomes：Characterization of a proposed drug delivery vehicle.J Control Release，2008，118（3）：275-284.

[6] Shangara Lal， Ulrich M. Lauer， Dietrich Niethammer， et al. Suicide genes： past，present and future perspectives. Immunology Today， 2000， 21（1）： 48-54.

[7] 孔恒，黃宗海，李強(qiáng)，等.腺病毒介導(dǎo)的雙自殺基因系統(tǒng)對乳腺癌細(xì)胞的殺傷作用.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2008， 28（6）： 907-910.

作者簡介：

郝軼，碩士，主治醫(yī)師，新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，830011。

基金項(xiàng)目：

篇3

對于顱內(nèi)膠質(zhì)瘤的研究已經(jīng)有一個多世紀(jì)的歷史，以前的治療方式都是對患者大腦半球切開，即使這樣，患者仍然會受到腫瘤復(fù)發(fā)的困擾。現(xiàn)如今，醫(yī)學(xué)研究人員會將手術(shù)切除、手術(shù)之后的化療和放療進(jìn)行綜合使用。近年來，一些新的觀念和研究方式層出不窮，醫(yī)學(xué)研究人員在不斷進(jìn)行臨床研究，效果明顯。

1膠質(zhì)瘤的手術(shù)前評估和手術(shù)切除

一般來說，手術(shù)切除是治療膠質(zhì)瘤的一種具體的途徑[1]。在進(jìn)行手術(shù)之前，工作人員應(yīng)該對腫瘤的生長速度，具體的部位以及血供情況進(jìn)行全面地探討和分析，做到全方面地了解。不僅如此，醫(yī)學(xué)研究人員還需要對患者的年齡，遺傳信息等進(jìn)行調(diào)查，將其寫到治療方案當(dāng)中，做好預(yù)測工作。

正常來說，手術(shù)應(yīng)該以全切形式為主，現(xiàn)如今，醫(yī)生所應(yīng)用的手術(shù)形式就是以熒光引導(dǎo)。由于人體內(nèi)部所含有的氨基乙酰丙酸是血紅素合成的主要產(chǎn)物，這種物質(zhì)可以被腫瘤轉(zhuǎn)化為卟啉，能夠用以輔助殘留腫瘤，其本身的實(shí)用價值比較高。在實(shí)際的研究中證明，全切的手術(shù)方式不僅效果比較明顯，而且還會減少復(fù)發(fā)率。

功能磁共振也是一種比較典型的治療方法，這種治療方式往往應(yīng)用到無創(chuàng)性手術(shù)。研究人員可以在不造成任何損壞的情況下進(jìn)行明確地定位，對于成像效果來說，采用彌散張量成像的形式是比較常見的?？梢酝ㄟ^對白質(zhì)纖維受壓位移情況進(jìn)行了解之后，才能夠提供更為合理的建議。對術(shù)前的信息進(jìn)行全面地了解，可以推動腫瘤切除手術(shù)的敏感程度，這樣可以有效的減少腦功能，同時還有助于腫瘤切除組織的高效發(fā)展。

現(xiàn)如今的安全手術(shù)方式有很多，其中比較典型的就是神經(jīng)影像學(xué)。但是這種治療方式也具有一定的局限性，主要是通過對局部的血流量進(jìn)行判定。皮層功能存在著嚴(yán)重的誤差，嚴(yán)重地影響到影像判定的精準(zhǔn)度。另外，手術(shù)過程中的電生理監(jiān)測也是一種標(biāo)準(zhǔn)的檢測方式，對語言區(qū)腫瘤的切除手術(shù)的正常進(jìn)行會起到一定的促進(jìn)作用[2]。

為了對手術(shù)切除程度和患者預(yù)后之間的關(guān)系進(jìn)行全面地了解，研究人員做出了不同的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腫瘤全切之后患者的預(yù)后效果，以及生活質(zhì)量等要明顯高于腫瘤半切的患者。因此，在實(shí)際的治療工作中，最好采用全切腫瘤的形式。

2術(shù)后的治療與放射治療

在高級別的膠質(zhì)瘤進(jìn)行切除手術(shù)后，很容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)的現(xiàn)象。因此，做好放療和化療工作是治療腫瘤的重要途徑。但是現(xiàn)如今的放療和化療的效果度不是非常理想，主要的原因就是血腦屏障會對化療藥物的吸收產(chǎn)生一定的阻礙作用，耐藥性也比較強(qiáng)。傳統(tǒng)的輔助化療方式對膠質(zhì)瘤不會產(chǎn)生任何的改善作用。從相關(guān)的臨床試驗(yàn)中可以看出，很多藥物可以被應(yīng)用到膠質(zhì)瘤患者的放化療中，其中替莫唑胺就是典型的代表，不良反應(yīng)也比較小。但是，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等惡性的腫瘤對于替莫唑胺這種藥物也具有一定耐藥性，在手術(shù)的早期就應(yīng)用相應(yīng)的化療藥物可以藥物的藥效。因此，在手術(shù)之后采用替莫唑胺藥物進(jìn)行化放療可以達(dá)到預(yù)期的效果。

在對顱內(nèi)膠質(zhì)瘤進(jìn)行治療的過程中，甲基轉(zhuǎn)移酶也是研究人員研究的重點(diǎn)。如果膠質(zhì)瘤呈現(xiàn)出陽性則耐藥性就比較強(qiáng)。因此，同樣可以也可以采用替莫唑胺來進(jìn)行治療。

另外，放射治療也是比較重要的治療方式。在實(shí)際的診療工作中主要是通過高能射線引入到腫瘤組織當(dāng)中，形成大分子的物質(zhì)結(jié)構(gòu)，其中比較典型的就是DNA物質(zhì)。在這些大分子物質(zhì)遭到損壞之后，就可以直接殺死腫瘤細(xì)胞。根據(jù)研究人員的實(shí)際研究，對于三級以上的惡性顱內(nèi)膠質(zhì)瘤而言，手術(shù)后放療的方式幾乎是一種普遍的治療方式。但是，不排除有腫瘤復(fù)發(fā)的可能性。防滲治療方式存在著一定的局限性，一些放射線可以對活躍期的細(xì)胞造成嚴(yán)重地破壞，而且腫瘤組織也會對放射線非常敏感。

TMZ無論是在體外膠質(zhì)瘤，還是膠質(zhì)瘤異體種植模型中均被作為放射增敏劑使用，其作用是導(dǎo)致有絲分裂死亡的增加而不是促進(jìn)細(xì)胞凋亡或細(xì)胞周期轉(zhuǎn)折點(diǎn)的激活。這進(jìn)一步鞏固了TMZ作為聯(lián)合放化療藥物的地位。

3膠質(zhì)瘤的基因治療及其他新思路

基因治療是指使用病毒等載體將外源性基因轉(zhuǎn)染至患者腫瘤細(xì)胞，以對其進(jìn)行殺滅或抑制其生長，主要的治療方案有：反義癌基因治療，自殺基因治療，抗血管基因治療，抑癌基因治療以及反義癌基因治療等。在體外實(shí)驗(yàn)中，這些治療方案均在不同水平上被證明有效，然而，以病毒為載體的基因治療的臨床試驗(yàn)顯示其對于延長患者生存期及限制腫瘤生長的效果并不顯著[3]，主要問題在于載體無法完整地分布于腫瘤組織，另外，載體DNA轉(zhuǎn)染的效率也偏低，如何在安全的基礎(chǔ)上提升基因轉(zhuǎn)運(yùn)效率成為迫切需要解決的問題，在這樣的背景下，以神經(jīng)干細(xì)胞為基礎(chǔ)的基因治療得到人們的重視。

4結(jié)論

總而言之，現(xiàn)階段顱內(nèi)高級別膠質(zhì)瘤的基本治療策略是在完善的術(shù)前評估下，進(jìn)行以手術(shù)治療為基礎(chǔ)的綜合治療。憑借術(shù)中導(dǎo)航及神經(jīng)電生理監(jiān)測技術(shù)可以在保護(hù)腦重要功能結(jié)構(gòu)的前提下盡量全切腫瘤，這為隨之而來的術(shù)后放、化療奠定了重要的基礎(chǔ)。以TMZ為基礎(chǔ)的輔助化療和聯(lián)合放化療已經(jīng)成為新的治療標(biāo)桿，對MGMT的測定為化療藥物的選擇提供了重要依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

篇4

肝臟血供豐富，是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的最常見的靶器官之一，在惡性腫瘤的發(fā)展過程中約25%-50%的原發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移至肝[1]。如何提高轉(zhuǎn)移性肝癌的治療有效率一直是腫瘤臨床工作的重點(diǎn)之一，正確認(rèn)識肝轉(zhuǎn)移癌的一般規(guī)律和特點(diǎn)，對進(jìn)一步提高該病的診治水平具有十分重要的意義。

1 肝轉(zhuǎn)移癌主要來源分析 常見肝轉(zhuǎn)移癌以消化道惡性腫瘤來源為主，所有的消化系統(tǒng)惡性腫瘤均可經(jīng)肝動脈、門靜脈及淋巴途徑轉(zhuǎn)移到肝臟，其中以消化道腺癌經(jīng)血行肝轉(zhuǎn)移最多見。

由于消化道原發(fā)灶全部由門靜脈回流至肝臟，且手術(shù)操作過程中牽拉、擠捏等常使脫落進(jìn)入血管的腫瘤細(xì)胞首先進(jìn)入肝臟，因而消化道癌易發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。從分子生物學(xué)的角度考慮，消化道癌細(xì)胞表面的糖蛋白CEA具有類似免疫球蛋白類細(xì)胞粘附分子功能，它由肝臟清除，在肝內(nèi)與肝細(xì)胞結(jié)合后，可作為粘附循環(huán)中腫瘤細(xì)胞的受體，而致腫瘤易在肝臟中滯留，進(jìn)一步激活新生血管而形成轉(zhuǎn)移灶[2]。從環(huán)境土壤學(xué)說來看，肝臟血供豐富，能夠?yàn)槟[瘤的高代謝特點(diǎn)提供營養(yǎng)保障。

2 肝臟病理損傷與肝轉(zhuǎn)移癌關(guān)系

2.1 肝纖維化/肝硬化與肝轉(zhuǎn)移癌關(guān)系 眾多的實(shí)驗(yàn)及臨床研究表明肝纖維化/肝硬化患者很少發(fā)生肝轉(zhuǎn)移癌。大多學(xué)者認(rèn)為肝硬化時形成諸多假小葉，由于再生的肝細(xì)胞結(jié)節(jié)的壓迫和結(jié)締組織的收縮，使肝內(nèi)血管、膽管均發(fā)生扭曲和閉塞，酶學(xué)系也發(fā)生相應(yīng)的變化，以及肝硬化時門靜脈壓力升高，肝臟收納胃腸系統(tǒng)的血流量減少。這些變化使已到達(dá)肝內(nèi)的癌細(xì)胞不適宜“著床”及生長。

2.2 肝炎病毒感染與肝轉(zhuǎn)移癌關(guān)系 UtsunormiyaT[3]報告感染乙肝或丙肝病毒的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移率(3/37,8.1%)較非感染者的肝轉(zhuǎn)移率(85/401,21.1%)明顯降低。HBsAg感染后出現(xiàn)肝功能損害、肝硬化可能是結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的不利因素。病毒感染本身和其引起的局部免疫變化可能起著重要作用。肝炎病毒能夠引起特異性免疫反應(yīng)，有效地抑制和殺滅循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞；同時微環(huán)境中NK細(xì)胞和吞噬細(xì)胞的增加，大大增強(qiáng)了局部組織的免疫功能。

2.3 脂肪肝與肝轉(zhuǎn)移癌關(guān)系 Karube等[4]通過向患有脂肪肝的大鼠體內(nèi)注入鼠結(jié)腸直腸癌細(xì)胞(RCN-9)，觀察到出現(xiàn)轉(zhuǎn)移性肝臟病變的大鼠數(shù)量明顯少于無脂肪肝的對照組，同時檢測到脂肪肝大鼠轉(zhuǎn)移病灶中的微血管密度(microvesseldensity,MVD)低于對照組大鼠，提示脂肪肝的環(huán)境不利于癌細(xì)胞的生長，轉(zhuǎn)移灶不易形成。

3 肝轉(zhuǎn)移癌的治療現(xiàn)狀分析

3.1 外科手術(shù)治療 結(jié)腸癌等原發(fā)病灶切除術(shù)后，盡可能行肝轉(zhuǎn)移灶切除術(shù)，外科手術(shù)依然是可切除病灶的標(biāo)準(zhǔn)治療，一旦有切除可能時，即應(yīng)進(jìn)行手術(shù)，從而最大程度減輕患者負(fù)擔(dān)，延長生存期。

3.2 局部治療方法 主要有射頻消融(RFA)、無水酒精注射、激光導(dǎo)熱治療(LITT)、微波凝固治療(MCT)、高功率聚焦超聲療法(HIFU)、冷凍治療、電化學(xué)治療等方法，其原理主要是采用物理或化學(xué)的方法導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡。

3.3 化療 肝臟出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶是原發(fā)腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的晚期癥狀表現(xiàn)，已處DukesD期，不管能否切除轉(zhuǎn)移灶，原則上均需根據(jù)轉(zhuǎn)移癌的病理類型選擇敏感藥物化療。給藥途徑有全身和區(qū)域性。

3.4 放療 肝轉(zhuǎn)移癌的癌細(xì)胞大多數(shù)是消化道來源的腺癌，對放療低度敏感，肝臟組織對放射線的耐受性差，全肝區(qū)放療已基本放棄不用，病灶聚焦放療有時仍在應(yīng)用，如γ刀、光子刀等的治療。

3.5 生物治療 生物治療包括免疫治療和基因治療兩大類，免疫治療是調(diào)動機(jī)體各種積極防御因素，提高機(jī)體免疫力，能過免疫機(jī)制達(dá)到治療腫瘤的目的?；蛑委熓菓?yīng)用基因工程技術(shù)，干預(yù)存在于靶細(xì)胞的相關(guān)基因表達(dá)水平以達(dá)到治療目的，包括直接或間接抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞，歸納為細(xì)胞因子、腫瘤疫苗、腫瘤藥物基因治療及調(diào)整細(xì)胞遺傳系統(tǒng)的基因療法，目前研究較多的是殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞生長的基因、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞免疫原性的基因、耐藥基因等。

3.6 中醫(yī)藥治療 中醫(yī)藥治療惡性腫瘤病人,應(yīng)用祛邪、扶正、化淤、軟堅(jiān)、散結(jié)、清熱解毒、化痰、祛濕及通經(jīng)活絡(luò)、以毒攻毒等原理，以中藥補(bǔ)益氣血、調(diào)理臟腑，配合手術(shù)后、放療和化療的治療、還可減輕毒副作用。

4 肝轉(zhuǎn)移癌的現(xiàn)代治療策略 近年來，圍繞提高肝轉(zhuǎn)移癌手術(shù)切除率和延長生存期，提出多學(xué)科專家組(multidisciplinaryteam，MDT)治療模式[5]。在病人治療前、治療中和治療后，由多個學(xué)科專家組成診療小組，定期進(jìn)行會議，以病人為中心，討論決定適合每個病人不同病期的診斷治療方案，以使病人獲得最佳的預(yù)后。

5 展望 各種治療方法均有不同程度的缺陷，比如手術(shù)及各種局部治療方法包括動脈栓塞化療在內(nèi)，對于潛藏在門脈系統(tǒng)內(nèi)的微小病變不能處理，從而導(dǎo)致復(fù)發(fā)；全身靜脈化療往往因藥物副作用不能使病灶內(nèi)藥物濃度達(dá)到最佳水平，致使腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)耐藥性等。相對而言，利用氣囊導(dǎo)管實(shí)施的經(jīng)皮肝隔離灌注術(shù)值得研究[6]。

參考文獻(xiàn)

[1] Quaia E,Bertolotto M,Forgacs B,et al.Detection of liver metastases by pulse inversion harmonic imaging during Levovist late phase:comparison with conventional ultrasound and helical CT in 160 patients[J].Eur Radiol,2003,13:475-483.

[2] Yoshioka T,Masuko t,Kotanagi H,et al.Homotypic adhesion through carcinoembryonic antigen plays a role in hepaticmetastasis development[J].Jpn J Cancer Res,1998,89(2):177.

[3] Utsunomiyat, Matsumata T.Metastatic carcinoma in the cirrhotic liver[J].Am J Surg,1993,166:776.

篇5

2．心力衰竭的基因治療

心臟收縮-舒張過程中任何一個環(huán)節(jié)的功能障礙都可能導(dǎo)致心肌的收縮和/或舒張功能降低，從而誘發(fā)心力衰竭的產(chǎn)生。心力衰竭的基因治療靶點(diǎn)即針對此過程中的鈣循環(huán)相關(guān)蛋白和調(diào)控因子?；蛑委煱ㄈ齻€基本要素:基因載體、轉(zhuǎn)移方式和靶基因。

(1)基因載體靶基因需要通過特定的載體轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中去，目前常用的基因載體主要分為非病毒載體和病毒載體兩大類。非病毒載體可大致分為質(zhì)粒DNA、脂質(zhì)體DNA復(fù)合物和高分子DNA復(fù)合物。寡核苷酸類及其類似物，亦可單獨(dú)或以復(fù)合物的形式作為一種非病毒載體用于基因轉(zhuǎn)移。一種可降解的高分子聚合納米粒子，具有強(qiáng)大的核酸容量，避免了腺病毒轉(zhuǎn)染有關(guān)的安全問題，適合作為基因載體，已得到了美國FDA的批準(zhǔn)［3］。病毒載體在臨床前研究中應(yīng)用更為廣泛，主要包括腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體(AAV)、反轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體，病毒載體的應(yīng)用大大提高了基因轉(zhuǎn)移的效率。重組人類腺病毒載體是轉(zhuǎn)基因治療模型中最常用的載體，它的優(yōu)勢在于:擴(kuò)增相對容易，可以達(dá)到較高的病毒滴度發(fā)揮功能，對靶細(xì)胞存在尤其是對心血管系統(tǒng)廣泛親嗜性。無論在體內(nèi)還是體外環(huán)境下，絕大部分心肌細(xì)胞都可以被腺病毒有效轉(zhuǎn)染。然而，將腺病毒應(yīng)用于臨床仍面臨許多挑戰(zhàn)。腺病毒進(jìn)入機(jī)體后，可能會引起強(qiáng)烈的免疫和炎癥反應(yīng)，這將限制其后續(xù)的表達(dá)。病毒可能感染所有的器官(尤其是肝臟)，不能呈現(xiàn)理想的組織選擇性。相對于腺病毒，雖然AAV、反轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體有著較低的免疫原性，但是AAV難以達(dá)到高效價的病毒滴度，對靶基因的裝載能力有限以及人體本身存在中和抗體等。反轉(zhuǎn)錄病毒載體不能轉(zhuǎn)染類似心肌細(xì)胞的不分裂細(xì)胞，慢病毒的生物安全性尚待評價。

(2)載體轉(zhuǎn)移途徑目的基因轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞，除了需要適宜的載體，還要有適合的轉(zhuǎn)移途徑。一些可增加血管通透性的化學(xué)物質(zhì)曾被用于促進(jìn)載體從血管腔轉(zhuǎn)移至心肌，如硝酸甘油、硝普鈉、5-羥色胺、緩激肽、組胺及血管內(nèi)皮生長因子等，但是對于臨床心力衰竭患者，考慮到以上物質(zhì)有降低血壓的作用，需謹(jǐn)慎應(yīng)用。常用的轉(zhuǎn)移途徑包括:①順向注射法:一種為阻塞冠狀動脈的順向注射法，即用球囊阻塞冠狀動脈近端，使病毒載體不會逆流或被稀釋，但此法存在安全隱患，因?yàn)榧词苟虝r間的冠狀動脈阻塞也可能不能耐受;另一種為非阻塞冠狀動脈的延長順向注射法，此法用于AAV的轉(zhuǎn)移最為有效，而且可作為心力衰竭患者不能耐受冠狀動脈阻塞法的最佳選擇。盡管這種方法并不能感染所有心肌(約60%)，但它更符合冠狀動脈的正常生理血流特點(diǎn)。重度心力衰竭患者接受攜帶SERCA2a的AAV1轉(zhuǎn)染的臨床研究，即采用了延長順向注射法。另一種為循環(huán)灌注技術(shù)，通過經(jīng)皮的最小微創(chuàng)手術(shù)建立心肌的獨(dú)立灌注區(qū)域，使冠狀動脈和冠狀竇之間形成一個閉合回路，此法在攜帶SERCA2a的腺病毒載體和AAV轉(zhuǎn)染綿羊心力衰竭模型中應(yīng)用，證實(shí)可顯著改善心肌收縮力［4］。②逆向注射法:經(jīng)冠狀靜脈逆向注射對于有冠狀動脈疾病的患者來說是一個非常好的選擇。然而，逆向注射法對不能耐受冠狀動脈阻塞的患者也存在操作困難。③直接注射法:經(jīng)過外科手術(shù)或經(jīng)皮介入將載體直接注入到心肌組織，此法可避免許多血管內(nèi)途徑帶來的潛在弊端:肝臟和脾臟的首過消除作用、中和抗體的效應(yīng)、T細(xì)胞應(yīng)答以及血管內(nèi)皮屏障的不滲透性。直接注射法僅將病毒載體轉(zhuǎn)移至注射部位心肌。④心包腔途徑:經(jīng)由心包將載體轉(zhuǎn)移，載體會優(yōu)先在心包鄰近的心肌細(xì)胞中表達(dá)。如何最優(yōu)化心包轉(zhuǎn)移法的治療效應(yīng)主要取決于多少比例的靶組織需要被糾正。局灶性的基因轉(zhuǎn)移適于局部缺血的心肌組織，彌散性的基因轉(zhuǎn)移更適于糾正整體的心功能不全。⑤手術(shù)轉(zhuǎn)移:通常需對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行開胸手術(shù)，繼而采用直接、順向或逆向注射。然而，臨床心力衰竭患者能否耐受此法尚待進(jìn)一步研究證實(shí)。

(3)靶基因理想的靶基因應(yīng)具備以下特性:在心力衰竭動物模型證實(shí)能改善心功能，無致心律失常性，量效關(guān)系明確，即靶基因表達(dá)越多，心臟功能的改善越明顯［5］。如表1所示，迄今用于心力衰竭轉(zhuǎn)基因治療的靶基因包括［6-18］:鈣循環(huán)相關(guān)蛋白:①過表達(dá)SERCA2a:早在20余年前，Gwathmey等即發(fā)現(xiàn)，無論心力衰竭病因如何均存在明顯的鈣循環(huán)異常，且部分歸因于SERCA2a的活性下降。大量的心力衰竭動物模型結(jié)果顯示，過表達(dá)SERCA2a基因可顯著增加心肌收縮功能，在容量負(fù)荷過重所致的心力衰竭豬模型，甚至可改善心室重構(gòu)［6-7］。另外，過表達(dá)SERCA2a可修復(fù)心肌能量供應(yīng)和利用的失衡，降低室性心律失常發(fā)生，增加冠狀動脈血流［8，19］。②抑制PLN:抑制PLN的表達(dá)，可起到與過表達(dá)SERCA2a相似的效應(yīng)，進(jìn)一步改善心肌的收縮和舒張功能。在起搏誘導(dǎo)的羊心力衰竭模型，通過基因沉默抑制PLN的表達(dá)，2周后，即顯示PLN抑制組左心室舒張末徑顯著減小，射血分?jǐn)?shù)顯著增加［9］。利用RNA干擾技術(shù)，將攜帶抑制PLN表達(dá)的基因序列的AAV9，通過靜脈注射轉(zhuǎn)染心臟結(jié)果顯示:PLN蛋白表達(dá)下降了75%，SERCA2a的活性部分恢復(fù)，心力衰竭大鼠的血流動力學(xué)特性顯著改善，收縮功能、舒張功能各項(xiàng)指標(biāo)均恢復(fù)正常，心室肥厚、心肌纖維化程度均明顯下降［10］。③S100A1:S100是一類鈣結(jié)合蛋白，其中S100A1主要在心臟表達(dá)。S100A1參與了對細(xì)胞內(nèi)外Ca2+調(diào)控的多個環(huán)節(jié)，可增加肌漿網(wǎng)SERCA2a和RyR2的活性促進(jìn)心肌的收縮和舒張，調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的順應(yīng)性和對Ca2+的反應(yīng)性，調(diào)控Ca2+介導(dǎo)的線粒體的能量代謝［20-21］。在心肌梗死后心力衰竭豬模型，通過冠狀靜脈逆向轉(zhuǎn)移法，將AAV-S100A1注射至左心室非梗死區(qū)結(jié)果顯示:注射14周后，S100A1治療組修復(fù)了肌漿網(wǎng)的鈣循環(huán)障礙，抑制了進(jìn)行性的心功能下降，逆轉(zhuǎn)了左心室重構(gòu)，且不增加室性心律失常的誘發(fā)率，證實(shí)了S100A1轉(zhuǎn)基因治療的長期有效性和安全性［11-12］。β腎上腺素受體(β-AR)系統(tǒng):心力衰竭患者的β-AR往往呈現(xiàn)為表達(dá)下調(diào)。將攜帶β2-AR的腺病毒經(jīng)冠狀動脈轉(zhuǎn)染兔心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后第1周、3周時，反映心肌收縮力的指標(biāo)dP/dtmax明顯增加，且心肌細(xì)胞對β-AR激動劑異丙腎上腺素的反應(yīng)性顯著增強(qiáng)［22］。過表達(dá)β2-AR的小鼠亦顯示心臟功能得到明顯改善。G蛋白偶聯(lián)受體激酶(GRK):β-ARs與G蛋白之間的相互作用是通過激酶對偶聯(lián)受體的磷酸化調(diào)節(jié)作用來實(shí)現(xiàn)的。GRK2是心臟中表達(dá)最多的GRK，它在心力衰竭時表達(dá)增加，導(dǎo)致β-AR信號通路敏感性下降，功能障礙。在心肌梗死后心力衰竭小鼠模型，選擇性的抑制GRK2表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10天后，GRK2抑制組小鼠生存率增高，心室重構(gòu)延緩，心肌的收縮力增強(qiáng)［23］。β-ARKct多肽是GRK2介導(dǎo)的β-AR失敏的抑制劑。將攜帶β-ARKct的腺病毒感染心梗后心力衰竭兔，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后3周，心室功能明顯改善［16］。β-ARKct過表達(dá)的陽性結(jié)果在豬的心力衰竭模型上亦得到驗(yàn)證［17］。腺苷酸環(huán)化酶(AC):心肌細(xì)胞接受兒茶酚胺刺激，經(jīng)由β-AR使細(xì)胞內(nèi)AC激活，生成cAMP，這是正常的生理反應(yīng)。分離過表達(dá)VI型AC的轉(zhuǎn)基因小鼠心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)cAMP表達(dá)增高，心功能增強(qiáng)［24］。在起搏誘導(dǎo)的心力衰竭豬模型，轉(zhuǎn)染攜帶Ⅵ型AC基因的腺病毒，結(jié)果顯示可顯著改善心臟功能和逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)，且這種效應(yīng)與cAMP的生成增多具有明顯相關(guān)性［18］。

3．心力衰竭基因治療的臨床試驗(yàn)

篇6

【中圖分類號】R635 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1004-7484（2014）06-3523-02

老年高血壓是常見的老年慢性疾病，具有腦出血、腦血栓、腦栓塞、心力衰竭、腎臟損壞等多種嚴(yán)重并發(fā)癥，是老年人致死或致殘的主要危險因素。流行病學(xué)調(diào)查顯示：我國65歲以上老年人中35%有高血壓，其中67.4%的患者血壓沒有得到較好的控制，因此實(shí)現(xiàn)老年高血壓患者平穩(wěn)、安全降壓，對減少并發(fā)癥及死亡具有重要意義。對本文就老年高血壓臨床特點(diǎn)及藥物治療現(xiàn)狀綜述如下。

1 老年高血壓臨床特點(diǎn)：老年患者因病程長、伴發(fā)病多、藥物治療種類多而具有以下特點(diǎn)[1-3]：

1.1 單純收縮期高血壓多：

表現(xiàn)為收縮壓升高、脈壓增大，并且隨著年齡增張，單純收縮期高血壓（Isolated Systolic Hypertension， ISH）發(fā)病率也在升高。研究顯示：隨著脈壓增大，老年患者心血管事件發(fā)生率及死亡率也在升高。

1.2 老年高血壓患者性低血壓及臥位高血壓發(fā)生率高：

多由于脫水、失血等誘因、或長期不規(guī)律服用降壓藥、抗抑郁藥等相關(guān)，治療上更注重糾正誘因、非藥物治療。

1.3 血壓波動大：

血壓“晨峰”現(xiàn)象多，同時易發(fā)生餐后低血壓（Postprandial Hypotension， PPH）。

1.4 老年高血壓多病共存情況多：

高血壓病程越長，靶器官受損的機(jī)會就越多，與多種疾病共存的機(jī)會就越高，如腦血管病（腦出血、缺血性腦卒中）、心臟疾?。ㄐ募」Ｋ?、心力衰竭）、腎臟疾?。ㄌ悄虿∧I病、腎功能受損）等。并且血壓控制不理想，發(fā)生率越高。

1.5 難治性高血壓發(fā)生率高，且難治性高血壓能加速靶器官損傷。

2 老年高血壓治療

老年高血壓降壓理念已由單純降壓轉(zhuǎn)為降壓達(dá)標(biāo)。高血壓治療的主要目的是：最大程度地降低心血管病發(fā)病和死亡危險。我國指南建議降壓目標(biāo)值確定為

2.1 利尿藥

利尿劑是臨床上應(yīng)用最早的降壓手段之一。2011年美國老年高血壓治療專家共識推薦利尿劑是老年降壓治療的一線藥物，而且也是聯(lián)合用藥的首選藥物。其作用原理主要是通過減少鈉和體液潴留，降低血容量而使血壓下降。適用于輕、中度高血壓，尤其適宜于老年人收縮期高血壓及心力衰竭伴高血壓的治療，可單獨(dú)用，并更適宜與其它類降壓藥合用。但是利尿藥物對于血糖、血脂、及尿酸有影響，對于合并有糖尿病、高脂血癥、高尿酸血癥患者應(yīng)用受限，長期應(yīng)用還需檢測電解質(zhì)，預(yù)防電解質(zhì)紊亂。有研究發(fā)現(xiàn)吲達(dá)帕胺和托拉塞米除有與普通利尿藥相似的降壓作用外，還有一定的抗鈣作用，是一種新型強(qiáng)長效降壓藥并且對血糖、血脂代謝影響小，尤其適用于左心室肥厚的輕中度高血壓患者，避免了高血糖、高脂血癥限制利尿藥物的應(yīng)用[5-6]。在老年高血壓患者中，特別是有心腦血管急癥高風(fēng)險因素的患者中，尤其要注意初始劑量需小，以免過度利尿引起機(jī)體脫水，血液高凝，易導(dǎo)致腦心梗等。

2.2 鈣通道阻滯劑

鈣通道阻滯劑（Calcium Channel Blockers， CCB）類藥物作用機(jī)制是通過抑制平滑肌L型鈣通道從而降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，使平滑肌松弛，血管擴(kuò)張從而發(fā)揮降壓作用。從結(jié)構(gòu)上分為二氫吡啶類和非二氫吡啶類。CCB由于其降壓治療耐受性好，尤其適用于血管彈性差、左心室舒張功能降低、合并其他心血管異常的老年患者，但是對于心臟傳導(dǎo)阻滯和心力衰竭患者禁用非二氫吡啶類鈣拮抗劑。目前指南推薦長效二氫吡啶類CCB作為老年高血壓患者降壓治療的基本藥物，與其它基本降壓藥物均可聯(lián)合使用[7]。該類藥物在老年高血壓患者應(yīng)用中需注意避免短效、大劑量應(yīng)用，預(yù)防性低血壓的發(fā)生。

2.3 β受體阻斷藥

其降壓機(jī)制是抑制交感神經(jīng)，降低心肌收縮力，減少心輸出量，增加左室射血分?jǐn)?shù)，改善心率變異性，增加心力衰竭患者的運(yùn)動耐量。β受體阻斷藥在高血壓治療中應(yīng)用存在爭議，日本抗高血壓指南不把該類藥物作為常用藥物，但在歐美及我國，該類藥物仍為基礎(chǔ)用藥，尤其適用于伴有冠心病的高血壓患者。該類藥物在老年高血壓治療應(yīng)用中需注意，因?yàn)槔夏昊颊叱４嬖谛膭舆^緩、竇房結(jié)功能異常、慢阻肺等疾病，臨床應(yīng)用時需嚴(yán)格掌握適應(yīng)癥，同時應(yīng)當(dāng)注意，盡量選擇卡維地洛、美托洛爾等高選擇性長效類β受體阻斷藥[8]。

2.4 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制藥和血管緊張素Ⅱ受體阻斷藥類藥物

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制藥（Angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI）主要降壓機(jī)制表現(xiàn)在兩點(diǎn)：其一就是抑制循環(huán)和局部組織中的轉(zhuǎn)換酶，使ACEI 不能轉(zhuǎn)變?yōu)檠芫o張素（Angiotensin type Ⅱ receptor， ATⅡ），從而使血管舒張，降低血壓； 另外就是減少緩激肽的降解，使體內(nèi)緩激肽水平升高，擴(kuò)張血管，降低血壓。ACEI不僅具有良好的降壓作用，對高血壓患者的并發(fā)癥及一些伴發(fā)疾病也有改善作用，尤其適用于伴有心力衰竭、左室肥大、糖耐量減低或糖尿病腎病蛋白尿等合并癥的患者[9-10]。禁用于高血鉀、妊娠、腎動脈狹窄患者。最常見的不良反應(yīng)是干咳，也是治療中停藥或者換藥的主要原因。

AT1受體拮抗劑（Angiotensin type Ⅱ receptor blockers， ARB）類藥物的降壓及腎臟保護(hù)作用與ACEI相似，咳嗽等副作用較少，血管神經(jīng)性水腫罕見，尤其適用于不能耐受ACEI出現(xiàn)咳嗽等副作用的患者。

2.5 α 受體阻滯劑

α1 受體阻斷劑能選擇性阻斷血管平滑肌突觸后膜的α1 受體，使血管擴(kuò)張，致外周血管阻力下降及回心血量減少，從而降低收縮壓和舒張壓本類藥物降壓作用明確，對血糖、血脂代謝無副作用為其優(yōu)點(diǎn)，但可能出現(xiàn)性低血壓耐藥性，使應(yīng)用受到限制。

3 抗高血壓治療的新技術(shù)

3.1 腎臟交感神經(jīng)射頻消融術(shù)

隨著醫(yī)學(xué)介入技術(shù)的不斷發(fā)展，在抗高血壓特別是難治性高血壓方面，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)皮導(dǎo)管腎臟交感神經(jīng)射頻消融術(shù)治療頑固性高血壓具有較好的應(yīng)用前景，同時腎臟交感神經(jīng)射頻消融術(shù)可改善糖代謝和耐藥性高血壓的控制情況[11-13]。腎交感神經(jīng)射頻消融術(shù)是治療頑固性高血壓的技術(shù)，在我國幾家醫(yī)院已應(yīng)用于臨床試驗(yàn)，但由于遠(yuǎn)期結(jié)果尚不明確，目前在國內(nèi)只有幾家醫(yī)院在專家嚴(yán)格把握適應(yīng)癥的條件下開展，不過相信隨著研究的不斷深入，腎交感神經(jīng)射頻消融術(shù)將會為難治性高血壓提供新的治療策略。

3.2 基因治療

遺傳因素作為高血壓發(fā)病的原因之一，基因治療也成為抗高血壓治療的熱點(diǎn)?；虔煼òɑ蛟鰪?qiáng)和基因抑制兩方面?；蛟鰪?qiáng)就是通過靜脈注射或靶組織局部注射將目的基因轉(zhuǎn)染到體內(nèi)，使之表達(dá)相應(yīng)蛋白以達(dá)到治療高血壓的目的，此類基因有一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase， NOS）基因、ANP基因、腎上腺髓質(zhì)素基因、腎素結(jié)合蛋白基因等；基因抑制主要采用反義技術(shù)和de2coy 技術(shù)，對引起血管收縮和高血壓的過分表達(dá)的基因采取反義抑制或封閉，抑制復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯，從而抑制引起高血壓的活性蛋白的產(chǎn)生，相關(guān)研究主要集中在血管緊張肽原和AT1受體的基因抑制[14-16]。目前動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)基因治療不僅能夠持續(xù)穩(wěn)定降壓，還有可能從遺傳基因?qū)用婵刂聘哐獕旱陌l(fā)病及家族遺傳。動物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果令人鼓舞，但是轉(zhuǎn)化到臨床應(yīng)用還有不少問題尚需解決，如靶基因的選擇與界定、安全有效的載體選擇等，還需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 許樹青，李紅虹，劉紅利，等.老年高血壓的臨床特點(diǎn)及治療策略[J]. 臨床急診雜志，2012，13（4）：287-288

[2] 李小鷹.老年高血壓的5大特點(diǎn)與臨床診治路徑[J].中華老年心腦血管病雜志，2013，15（6）：670-672

[3] 蹇在金. 老年人高血壓的臨床特點(diǎn)[J]. 中華老年醫(yī)學(xué)雜志，2005，24（4）：317-319

[4] 中國老年學(xué)學(xué)會心腦血管病專業(yè)委員會，中國醫(yī)師協(xié)會循證醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會. 老年高血壓的診斷與治療中國專家共識（2011版）. 中國心血管病研究，2011，9：801-808

[5] 莫劍良.抗高血壓藥物及其聯(lián)用的研究進(jìn)展[J].科技創(chuàng)新導(dǎo)報，2010，34：11

[6] 張杏顏.抗高血壓藥物的研究進(jìn)展[J].臨床合理用藥，2011，4（6）：147-148

[7] 葉建全，孫慧超.長效鈣拮抗劑治療高血壓的療效[J].中國當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2013，20：34-35

[8] 劉興斌. 臨床醫(yī)生如何應(yīng)對β受體阻滯劑的爭議[J].心血管病學(xué)進(jìn)展，2007，28 （5）：672-675

[9] Dr Anushka Patel， FRACP， ADVANCE Collaborative Group. Effects of a fixed combination of perindopril and indapamide on macrovascular and microvascular outcomes in patients with type 2 diabetes mellitus （the ADVANCE trial）： a randomised controlled trial [J]. The Lancet，2007，370：829-840

[10]吳文靜，王曉莉.ACEI 類藥物臨床應(yīng)用研究的新進(jìn)展[J].中日友好醫(yī)院學(xué)報，2005，21（4）：113

[11]劉芳，劉梅林.經(jīng)導(dǎo)管腎交感神經(jīng)消融治療頑固性高血壓的進(jìn)展[J].中國心血管雜志，2013，18（1）：75-78.

[12] Mahfoud F， Schlaich M， Kindermann I， et al. Effect of renal sympathetic denervation on glucose metabolism in patients with resistant hypertension[J]. Circulation， 2011， 123 （ 18）：1940-1946

[13] 蔣雄京，梁拓，董徽，等.經(jīng)導(dǎo)管射頻消融腎交感神經(jīng)治療難治性高血壓的近期療效和安全性[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志，2012，92（ 46） ： 3265-3268

篇7

【關(guān)鍵詞】 腺病毒；骨形態(tài)發(fā)生蛋白2；骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；基因治療

BMP2是最主要的骨形成調(diào)控因子之一，在體內(nèi)和體外能夠誘導(dǎo)干細(xì)胞分化和骨形成。骨組織工程中應(yīng)用緩釋技術(shù)將BMP2加入載體的方法雖然取得了一些成果，但從理論到技術(shù)均有尚不完善之處。本實(shí)驗(yàn)采用體外基因治療策略，將攜帶BMP2基因的重組缺陷型腺病毒表達(dá)載體（AdBMP2）轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，檢測BMP2基因表達(dá)，觀察基因轉(zhuǎn)染對BMSCs增殖及成骨分化的影響，探討其作為內(nèi)源性BMP2的“生物發(fā)生器”以及骨組織工程種子細(xì)胞的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 腺病毒載體及細(xì)胞 AdBMP2、攜帶β半乳糖酐酶基因的腺病毒對照載體（AdLacz）和人胚腎293細(xì)胞，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院骨科李建軍博士提供。通過感染293 細(xì)胞擴(kuò)增病毒，測定AdBMP2滴度為2×1010 PFU·ml-1。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 新西蘭大耳白兔，雌雄不限，體質(zhì)量2.0～2.5kg，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SCXK（遼2003-0013）。

1.1.3 主要試劑 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（北京?？寺∩镏破酚邢薰荆?；胎牛血清（天津?yàn)笊镏破酚邢薰荆?；BMP2單克隆抗體、原位雜交檢測試劑盒和免疫組織化學(xué)試劑盒（武漢博士德生物工程公司）；骨鈣素、Ⅰ型膠原單克隆抗體（Santa Crus公司）；二抗FITC標(biāo)記IgG（北京中杉金橋）；Xgal（大連寶生物公司）;堿性磷酸酶檢測試劑盒（南京建成生物工程公司）。

1.1.4 主要儀器 垂直電泳儀（BioRad）；轉(zhuǎn)印電泳儀（Amersham公司）；可調(diào)溫?fù)u床（哈爾濱東聯(lián)公司）；臺式低溫離心機(jī)（Eppendorf公司）；流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃集團(tuán)MK3）；熒光顯微鏡（日本 Olympus）。

1.2 方法

1.2.1 兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 用全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)BMSCs，2周左右貼壁細(xì)胞基本長滿單層，即得到原代培養(yǎng)細(xì)胞。按1∶3或1∶4比例分瓶傳代培養(yǎng)。BMSCs（P2）長至基本融合時，更換成含2%FBS的DMEM培養(yǎng)液，細(xì)胞計數(shù)，根據(jù)病毒滴度按感染倍數(shù)（MOI）為100（即1個細(xì)胞用100個病毒顆粒感染）加入相應(yīng)體積的AdBMP2，過夜。次日換成含10%FBS的DMEM正常培養(yǎng)液培養(yǎng)2 d。同等條件下AdLacz轉(zhuǎn)染細(xì)胞（MOI=100），Xgal免疫染色檢測轉(zhuǎn)染效率。實(shí)驗(yàn)組：AdBMP2轉(zhuǎn)染；實(shí)驗(yàn)對照組：AdLacz轉(zhuǎn)染；空白對照組：未轉(zhuǎn)染。

1.2.2 原位雜交、免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測細(xì)胞內(nèi)BMP2基因表達(dá) 取各組細(xì)胞，以1×105 ml-1的密度接種于多聚L賴氨酸處理過的蓋玻片上，待貼壁細(xì)胞密度達(dá)到50%左右時取出蓋玻片，PBS漂洗3次，4％多聚甲醛固定。分別按BMP2原位雜交、免疫組化試劑盒操作步驟進(jìn)行操作，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，透明，封片，光鏡觀察。

1.2.3 Western blotting檢測培養(yǎng)液中BMP2蛋白 各組細(xì)胞換無血清培養(yǎng)液孵育12h，收集培養(yǎng)液20ml，凍干機(jī)凍干后加入50μl上樣緩沖液。取10μl樣品，煮沸5min，離心5min，上清以12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（12%SDSPAGE）分離。SDSPAGE電泳在恒壓條件下進(jìn)行，濃縮膠中為120V，分離膠中為160V。常規(guī)轉(zhuǎn)膜，封閉，然后按膜面積計算一抗用量（0.1ml·cm-2），使用Tween 20PBS按比例稀釋一抗（BMP2單克隆抗體），與濾膜4℃溫浴3h；以TPBS按比例稀釋二抗（辣根酶標(biāo)記抗體），與濾膜室溫溫浴1h；加入生色底物溶液（PBS 9ml+二氨基聯(lián)苯胺9mg+0.3%LiCl2 1ml，最后加入H2O2至0.14%），室溫?fù)u動觀察條帶顏色清晰，PBS終止顯色反應(yīng)，洗滌，干燥，避光保存。rhBMP2標(biāo)準(zhǔn)蛋白20ng作為陽性對照組。

1.2.4 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期 每組細(xì)胞各取6 瓶（1×106瓶-1），胰酶消化收集細(xì)胞，用1ml PBS制成單細(xì)胞懸液，加入75%冰乙醇4ml固定12h，100μg·ml-1碘化丙啶避光染色30min，震蕩混勻，上機(jī)檢測，聯(lián)機(jī)軟件測定分析細(xì)胞周期各時相比例，數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計軟件處理，方差分析比較。

1.2.5 ALP活性檢測 每組細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，加100μl 2％Triton100，4℃過夜，按ALP活性檢測試劑盒說明操作，測定吸光度，計算酶活性值。同時設(shè)空白對照。計算均數(shù)，組間差異用 t 檢驗(yàn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.2.6 免疫熒光檢測骨鈣素（OCN）、Ⅰ型膠原表達(dá) 將各組細(xì)胞接種于預(yù)置有蓋玻片的6孔板內(nèi)，2周后取出玻片，PBS漂洗3次，4％多聚甲醛固定。免疫熒光法分別檢測OCN、Ⅰ型膠原表達(dá)，0.2% Triton X100透化處理，10% BSA室溫封閉，一抗4℃濕盒孵育過夜，二抗FITC標(biāo)記IgG室溫避光孵育2 h，PBS漂洗3次，95%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)

果

2.1 AdBMP2轉(zhuǎn)染BMSCs及轉(zhuǎn)染率檢測

轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，邊界清晰，生長旺盛，細(xì)胞核較大，呈圓形或橢圓形，胞漿中顆粒較多，隨培養(yǎng)時間延長多角型細(xì)胞增多。AdLacz轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞可編碼產(chǎn)生β半乳糖酐酶，作用于生色底物Xgal，反應(yīng)產(chǎn)物呈藍(lán)色。與AdBMP2轉(zhuǎn)染同等實(shí)驗(yàn)條件下（MOI=100），腺病毒轉(zhuǎn)染效率高達(dá)90%以上（圖 1）。

2.2 BMP2基因在BMSCs內(nèi)的表達(dá)

原位雜交及免疫細(xì)胞化學(xué)染色均顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞質(zhì)中有較多棕黃色強(qiáng)陽性染色顆粒（圖 2、3），而實(shí)驗(yàn)對照及空白對照組則為陰性。結(jié)果表明：AdBMP2轉(zhuǎn)染的BMSCs中BMP2基因在mRNA和蛋白水平均呈高效表達(dá)。

2.3 Western blotting檢測培養(yǎng)液中BMP2蛋白

Western blotting檢測顯示AdBMP2轉(zhuǎn)染組有BMP2強(qiáng)陽性條帶，AdLacz轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組為弱陽性條帶。AdBMP2轉(zhuǎn)染BMSCs后，分泌的BMP2蛋白含量遠(yuǎn)高于實(shí)驗(yàn)及空白對照組（圖 4）。結(jié)果表明：AdBMP2轉(zhuǎn)染的BMSCs中分泌性BMP2蛋白高效表達(dá)。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期

分析細(xì)胞周期結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組與實(shí)驗(yàn)對照組及空白對照組的G1期、S期細(xì)胞比例無顯著差異（P>0.05），表明AdBMP2轉(zhuǎn)染后，BMSCs的DNA合成以及細(xì)胞的增殖未因轉(zhuǎn)染受影響(見表1)。表1 細(xì)胞周期流式細(xì)胞儀分析結(jié)果 AdBMP2轉(zhuǎn)染組ALP活性為(30.21±1.85) U·ml-1，AdLacz轉(zhuǎn)染組為(19.56±2.09) U·ml-1，未轉(zhuǎn)染組為(20.65±1.93) U·ml-1，經(jīng) t 檢驗(yàn)分析，AdBMP2轉(zhuǎn)染細(xì)胞組ALP活性較實(shí)驗(yàn)對照組及空白對照組明顯增高，差異有顯著性（P﹤0.01）。

2.6 免疫熒光檢測OCN、Ⅰ型膠原表達(dá)

AdBMP2轉(zhuǎn)染細(xì)胞的胞漿內(nèi)有大量陽性綠色熒光物質(zhì)（圖5、6），而實(shí)驗(yàn)對照組及空白對照組細(xì)胞均為陰性。結(jié)果表明，AdBMP2轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞內(nèi)有骨鈣素、Ⅰ型膠原的高效表達(dá)，提示BMSCs向成骨細(xì)胞表型分化。

3 討

論

BMSCs因其取材方便，易于分離，體外增殖能力強(qiáng)，具有多方向分化潛能，經(jīng)誘導(dǎo)可成骨分化，是目前骨組織工程中應(yīng)用最為廣泛的種子細(xì)胞。研究表明，單純BMSCs作為種子細(xì)胞向成骨分化過程較慢，并非是一個自發(fā)的過程，需要細(xì)胞因子及特定的體內(nèi)環(huán)境作用，而且成骨分化后細(xì)胞表型的維持也需要細(xì)胞因子的作用［1］。體內(nèi)移植后早期細(xì)胞外基質(zhì)形成不足時，植入的細(xì)胞也會失去依托和緊密的細(xì)胞間黏附，局部的成骨微環(huán)境形成將受到阻礙，不能及早確立優(yōu)勢成骨細(xì)胞群而將阻礙成骨。本實(shí)驗(yàn)中也觀察到 BMSCs的ALP活性較低，OCN、Ⅰ型膠原含量少，提示成骨活性較弱。因此，BMSCs需經(jīng)改造以增強(qiáng)成骨活性才能成為理想的種子細(xì)胞。

圖 6 Ⅰ型膠原免疫熒光（×100）

BMP2是被公認(rèn)最強(qiáng)的成骨誘導(dǎo)因子之一，是調(diào)控BMSCs向成骨方向定向分化的主要因子，而且已開始應(yīng)用于臨床［2］。但BMP2的制備過程復(fù)雜，產(chǎn)量低；活性不穩(wěn)定，在體內(nèi)環(huán)境代謝快，骨誘導(dǎo)時間短；作為外源性蛋白植入體內(nèi)，用量大時可能會產(chǎn)生毒性反應(yīng)，還可能引起免疫排斥反應(yīng)［3］；有報道致力于采用緩釋技術(shù)來解決這些缺陷，然而支架材料中能否整合足夠量的BMP2并持續(xù)穩(wěn)定釋放，而且BMP2對理化處理是高度敏感的，在支架材料中能否保持生物活性，成為難以解決的問題［4］。應(yīng)用基因治療技術(shù)可將成骨誘導(dǎo)因子的目的基因?qū)氚屑?xì)胞，經(jīng)過基因修飾的細(xì)胞可持續(xù)表達(dá)細(xì)胞因子，可在局部根據(jù)需要持續(xù)、穩(wěn)定、靶向釋放內(nèi)源性細(xì)胞因子，促進(jìn)成骨，并起到維持成骨細(xì)胞表型的作用，克服直接應(yīng)用外源性細(xì)胞因子可能產(chǎn)生的上述缺點(diǎn)。

重組復(fù)制缺陷型腺病毒因其毒性低、靶細(xì)胞范圍廣泛、轉(zhuǎn)染率高、不與靶細(xì)胞發(fā)生基因整合等優(yōu)點(diǎn)，成為基因治療中常用的載體之一。本研究在重組缺陷型腺病毒載體介導(dǎo)下將BMP2基因?qū)隑MSCs，與實(shí)驗(yàn)對照組比較，AdBMP2轉(zhuǎn)染的BMSCs中BMP2基因在mRNA及蛋白水平呈高效表達(dá)，培養(yǎng)液中BMP2含量較高。而且觀察到AdBMP2轉(zhuǎn)染的BMSCs中ALP活性增強(qiáng)，OCN、Ⅰ型膠原呈陽性表達(dá)。ALP活性被認(rèn)為是衡量BMSCs向成骨細(xì)胞方向分化程度和成骨細(xì)胞功能狀態(tài)的一個重要指標(biāo)［5］。Ⅰ型膠原蛋白主要由成熟的成骨細(xì)胞合成分泌，是成骨細(xì)胞的重要標(biāo)志物之一［6］。OCN是骨代謝細(xì)胞分化成熟、處于功能狀態(tài)的標(biāo)志［7］。因此根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以認(rèn)為，BMP2基因修飾的BMSCs向成骨細(xì)胞表型分化，提示BMP2基因的轉(zhuǎn)染使BMSCs高效表達(dá)、分泌的內(nèi)源性BMP2，通過自分泌或旁分泌增強(qiáng)了自身的成骨活性。BMP2促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的機(jī)理還不十分清楚，目前認(rèn)為BMP2并不直接作用于靶基因，而是通過BMP2、受體、信號途徑和靶基因組成的一個較完整的信號系統(tǒng)發(fā)揮成骨誘導(dǎo)作用，BMP2處于系統(tǒng)的核心和啟位點(diǎn)［8］。

細(xì)胞分化與增殖的矛盾是細(xì)胞生物學(xué)特征之一，即分化低的細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，分化高的細(xì)胞增殖能力差。本實(shí)驗(yàn)觀察到AdBMP2轉(zhuǎn)染BMSCs促進(jìn)了其向成骨細(xì)胞的定向分化，但通過流式細(xì)胞儀檢測分析細(xì)胞周期的結(jié)果顯示，AdBMP2轉(zhuǎn)染的BMSCs的增殖能力并未受影響，與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞無差異，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況也證實(shí)了這一點(diǎn)?？紤]除了與BMSCs強(qiáng)大的增殖能力有關(guān)外，可能還與BMP2對BMSCs增殖有促進(jìn)作用有關(guān)。

綜上所述，采用基因技術(shù)，通過重組復(fù)制缺陷型腺病毒載體介導(dǎo)，可將BMP2基因高效導(dǎo)入BMSCs，基因轉(zhuǎn)染的BMSCs不僅提供了內(nèi)源性BMP2的局部來源，而且提供了BMP2自身效應(yīng)的靶細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了向成骨細(xì)胞的定向分化并保持了強(qiáng)大的增殖能力，有望成為骨組織工程中比較理想的種子細(xì)胞。至于基因轉(zhuǎn)染的BMSCs能否在局部根據(jù)需要持續(xù)、穩(wěn)定釋放內(nèi)源性BMP2，植入體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸，以及腺病毒載體的安全性等問題尚需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

［1］YAMAGUCHI A，ISHIZUYA T，KINTOU N，et al.Effects of BMP2，BMP4，and BMP6 on osteoblastic differentiation of bone marrowderived stromal cell lines，ST2 and MC3T3G2/PA6［J］.Biochem Biophys Res Commun，1996，220：366371.

［2］BODEN S D，GROB D，DAMIEN C.Ne2steo bone growth factor for posterolateral lumbar spine fusion:results from a nonhuman primate study and a prospective human clinical pillot study［J］.Spine，2004，29(5)：504514.

［3］CAMPER Y.Bone grafts and substitutes［J］.Orthop Network，1995，6：79.

［4］吳宗鍵，王繼芳，盧世璧.誘導(dǎo)成骨的局部基因治療［J］.中華骨科雜志，2001，21(12)：760762.

［5］RAWADI　G，VAYSSIERE B，DUNN F，et al.BMP2 controls alkaline phosphatase expression and osteoblast mineralization by a Wnt autocrine loop［J］.J Bone Miner Res，2003，18(10)：18421853.

篇8

基因編輯技術(shù)是一項(xiàng)對基因組進(jìn)行精確定點(diǎn)修飾的技術(shù)，可對特定DN段進(jìn)行敲除、加入和替換等，從而在基因組水平上進(jìn)行精確的基因編輯。此過程模擬了基因的自然突變，修改并編輯了生物的基因組，使研究人員可以在極短時間內(nèi)模擬自然界漫長時間的基因演變，甚至能夠完成自然進(jìn)化中無法完成的基因組改變。在科研領(lǐng)域，該技術(shù)可以快速構(gòu)建模式動物，節(jié)約大量科研時間和經(jīng)費(fèi)；在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，該技術(shù)可以人為改造基因序列，使之符合人們的要求，研制如改良水稻等糧食作物；在醫(yī)療領(lǐng)域，該技術(shù)可以更加準(zhǔn)確、深入地了解疾病發(fā)病機(jī)制和探究基因功能，以及改造人的基因，達(dá)到基因治療的目的等。因此，基因編輯技術(shù)具有極其廣泛的發(fā)展前景和應(yīng)用價值。

鋅指核酸酶（zincfinger nucleases，ZFN）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶 （transcription activatorlike effector nucleases，TALENs）和成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）是三大基因編輯技術(shù)。這3種技術(shù)皆是通過在特定的靶向序列處引入雙鏈斷裂缺口（doublestrand break，DSB），繼而通過NHEJ途徑（nonhomologous end joining，NHEJ）和HR（homologous recombination，HR）途徑這2種細(xì)胞內(nèi)DNA修復(fù)機(jī)制完成修復(fù)。NHEJ途徑（nonhomologous endjoining，NHEJ）使基因MDNA缺口處有堿基的插入或者缺失，造成移碼突變，導(dǎo)致基因的敲除；HR（homologous recombination，HR）途徑在提供外源DNA模板的條件下使基因組DNA得到精確的基因修復(fù)或靶向基因的添加[1]。由此可見，這3種基因編輯技術(shù)本質(zhì)上均是利用非同源末端鏈接途徑修復(fù)和同源重組修復(fù)，聯(lián)合特異性DNA靶向識別及核酸內(nèi)切酶完成的DNA序列改變。

11ZFNs每個鋅指核酸酶單體都是由鋅指蛋白（zinc finger protein，ZFP）與非特異核酸酶結(jié)合的人工合成酶。此酶的N端部分是能識別含有特定DNA序列的鋅指蛋白，C端部分則由非特異性切割結(jié)構(gòu)域Fok I以及連接DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和內(nèi)切酶的肽段組成[23]。ZFN的特異性取決于ZFP，因此篩選高質(zhì)量的ZFP是獲得高效、特異性的ZFN的前提[47]。ZFP通常由3～6個鋅指組成，每個鋅指識別基因組中連續(xù)的3個堿基。ZFP一旦與基因組中的特定序列結(jié)合，F(xiàn)ok I核酸內(nèi)切酶便會形成二聚體發(fā)揮內(nèi)切酶活性，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂的缺口，繼而通過細(xì)胞內(nèi)修復(fù)機(jī)制對斷裂部位的基因進(jìn)行修飾[811]（圖1）。ZFN的基因打靶效率一般能夠達(dá)到30%，可以做到針對特定序列設(shè)計ZFN來實(shí)現(xiàn)對靶基因的修飾。然而ZFN識別結(jié)構(gòu)域存在的上下文依賴效應(yīng)大大降低了ZFN設(shè)計和篩選效率。目前尚不能針對任意一段序列均可設(shè)計出滿足要求的ZFN，也不能在每一個功能性染色體區(qū)段都能夠順利找到適合的ZFN作用位點(diǎn)。在ZFN的篩選和設(shè)計方面存在較大的技術(shù)困難之外，其制備價格也比較昂貴。此外，ZFN的脫靶切割也往往會導(dǎo)致細(xì)胞毒性。綜上這些因素使得ZFN在基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用有一定的局限性。

12TALENsTALEN是植物病原菌黃單胞桿菌Xanthomonas sp.產(chǎn)生的TALE蛋白的中央?yún)^(qū)域結(jié)構(gòu)域與FokⅠ核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域組合而成的一類重組核酸酶。TALE蛋白的中央?yún)^(qū)域結(jié)構(gòu)域是該蛋白識別特異DNA序列的結(jié)構(gòu)域。它包含了155～195個蛋白單元模塊，每個模塊單元有34個氨基酸殘基，其中除第12和13位氨基酸可變外，其他氨基酸都是保守的。因此，這第12和13位氨基酸被稱作重復(fù)可變的雙氨基酸殘基（repeat variable diresidues，RVDs） 位點(diǎn)[12]，是靶向識別的關(guān)鍵。由于TALE存在多種變體，所以可以構(gòu)建出靶向基因組中預(yù)設(shè)DNA靶位點(diǎn)的多種TALEN。相比ZFN技術(shù)，TALEN使用了TALE蛋白的中央?yún)^(qū)域結(jié)構(gòu)域代替ZFP作為人工核酸酶的識別結(jié)構(gòu)域，更好地解決了DNA序列識別特異性低的問題。TALE蛋白中央?yún)^(qū)域結(jié)構(gòu)域?qū)A基的識別只由2個氨基酸殘基決定：組氨酸天冬氨酸特異識別堿基C，即HD（His Asp）C；天冬酰胺異亮氨酸識別堿基A，即NI（Asn Ile）A；天冬酰胺甘氨酸識別堿基T，即NG （AsnGly）T；天冬酰胺天冬酰胺識別堿基G或A，即NN（AsnAsn）G或A；天冬酰胺賴氨酸識別堿基G，即NK（Asn Lys）G；天冬酰胺絲氨酸可以識別A，T，G，C 中的任一種NS （AsnSer）A，T，C，G [1314]（圖2）。這種與DNA堿基一一對應(yīng)的方式在設(shè)計上相對于ZFN要簡單得多。然而，在實(shí)際構(gòu)建過程中，TALE分子的模塊組裝和篩選過程也比較繁雜，通常需要大量的測序工作。這使得該技術(shù)的使用成本較高，對于普通實(shí)驗(yàn)室的可操作性較低。此外，TALEN分子比ZFN大得多，因而在不能高效導(dǎo)入細(xì)胞方面也限制了它的應(yīng)用。

13CRISPR/Cas9CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPRassociated protein）系統(tǒng)是在細(xì)菌和古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的一種獲得性免疫系統(tǒng)[15]，由成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列CRISPR與Cas蛋白組成，能特異性識別外源病毒或質(zhì)粒的核酸物質(zhì)，并對其進(jìn)行剪切，起到防疫外源核酸入侵的作用[16]。其中CRISPR簇通過轉(zhuǎn)錄生成一段非碼RNA，即CRISPR前體

的靶標(biāo)可設(shè)計為針對一個基因，也為針對多個基因，都能達(dá)到有效的特異性位點(diǎn)編輯的效果。CRISPR/Cas9系統(tǒng)已被公認(rèn)為是繼“鋅指核酸內(nèi)切酶（ZFN）”、“類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN）”之后出現(xiàn)的第3代“基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)”。ZNFs和TALENs作用時均是采用蛋白質(zhì)對DNA序列的識別，而CRISPR/Cas9對靶序列的識別是RNA與DNA的堿基配對過程。該識別方式使得CRISPR/Cas9與前二者相比更為精準(zhǔn)，降低了脫靶切割的幾率，減低了細(xì)胞毒性。CRISPR/Cas9所有成分都可以通過導(dǎo)入質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)，因此也省去了耗時耗力的蛋白質(zhì)工程過程。同時，研究人員可以通過生物信息學(xué)分析，設(shè)計出針對絕大多數(shù)基因的特異性靶標(biāo)識別crRNA。因此，與前2代技術(shù)相比，CRISPR/Cas9成本低、制作簡便、快捷高效、脫靶率低的優(yōu)點(diǎn)使其迅速風(fēng)靡于世界各地的實(shí)驗(yàn)室，成為科研、醫(yī)療等領(lǐng)域的有效工具，逐漸成為當(dāng)今分子生物學(xué)領(lǐng)域最炙手可熱的技術(shù)之一。然而CRISPR/Cas9 系統(tǒng)也存在著一些不完美之處：Cas9 蛋白對于目標(biāo)序列的識別除了依靠crRNA序列的匹配之外，目標(biāo)序列附近必須存在一些小的前間區(qū)序列鄰近基序（PAM），因此Cas9 蛋白對于設(shè)定序列的切割仍有局限性；另外和ZFNs及TALENs技術(shù)一樣，CRISPR/Cas9也面臨著如何控制雙鏈斷裂之后的非同源末端連接修復(fù)可能會隨機(jī)產(chǎn)生細(xì)胞毒性的問題。

14 NgAgoCRISPR是以RNA為向?qū)ふ野邢蛐蛄校鳱gAgo則是以DNA來擔(dān)任向?qū)?。韓春雨等的工作顯示，NgAgo可結(jié)合24個堿基的gDNA，比CRISPR結(jié)合19個堿基的gRNA要長5個堿基，因此理論上精確性要高1 024倍，脫靶率也較低。然而，不同于CRISPR/Cas9技術(shù)大量運(yùn)用已獲得了實(shí)踐驗(yàn)證，NgAgo的作用效果還有待于今后工作的檢驗(yàn)。

2基因編碼技術(shù)的應(yīng)用

21在基因治療中的應(yīng)用隨著DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)和以DNA重組技術(shù)為代表的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以及人類對疾病認(rèn)識的不斷深入，越來越多的證據(jù)表明，許多疾病都與基因突變、缺失或表達(dá)異常有關(guān)，由此基因治療技術(shù)順勢而生?；蛑委熓侵笐?yīng)用基因工程技術(shù)將正常基因或有治療作用的基因引入患者細(xì)胞內(nèi)，以糾正致病基因的缺陷而根治疾病。其最核心的策略是通過細(xì)胞內(nèi)基因修飾來治療疾病。近兩三年來，基因編碼技術(shù)作為該策略的新生力量開始活躍在基因治療的舞臺上，在癌癥、遺傳性疾病和逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)的傳染病等疾病的治療方面取得許多堪稱跨時代的佳績。

癌癥治療方面：2015年11月英國倫敦大奧蒙德街醫(yī)院（Great Ormond Street Hospital）的醫(yī)生第一次依靠使用“分子剪刀”修改基因的療法，成功地治愈了一名患有“無法治愈的”白血病的1歲女孩“萊拉”（Layla）。其治療方案是利用TALEN蛋白對異體T細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，去除內(nèi)源性TCR（提高腫瘤殺傷特異性）及CD52（避免藥物alemtuzumab的干擾），并命名為antiCD19 CART細(xì)胞，再將這些經(jīng)過設(shè)計的“人工培育的免疫細(xì)胞”輸入患者體內(nèi)去捕捉和殺傷腫瘤細(xì)胞。經(jīng)過1個月的治療，這名女孩目前擺脫了癌癥，身體狀況很不錯，成為世界上首次用基因編輯治愈的白血病女孩[18]。此外，科學(xué)家們在過去的幾十年中已經(jīng)確定了許多腫瘤治療中相關(guān)的基因，包括原癌基因、抑癌基因、基因組修飾類、基因抗藥性基因。近2年，研究者們已經(jīng)開始利用基因編碼技術(shù)對上述基因開展了大規(guī)模的基因編輯修飾研究，預(yù)計今后幾年內(nèi)會出現(xiàn)多項(xiàng)癌癥治療方面的重大突破。

遺傳性疾病治療方面：2015年底《Nature》雜志發(fā)表的對2016年熱點(diǎn)研究領(lǐng)域的展望（The science to look out for in 2016）中提到美國加利福尼亞州里士滿Sangamo生物科學(xué)公司將計劃開展利用ZFN糾正導(dǎo)致血友病基因缺陷的人體試驗(yàn)，并對其研究成果表示非常期待。另外該公司還與馬薩諸塞州劍橋市的Biogen公司合作開始了另一項(xiàng)試驗(yàn)，嘗試通過該技術(shù)提高β地中海貧血患者體內(nèi)一種血液球蛋白的功能[19]。已有研究證實(shí)人β珠蛋白（HBB）基因的突變可能導(dǎo)致地中海貧血癥。我國中山大學(xué)黃軍就和他的團(tuán)隊(duì)利用CRISPRCas9基因編輯技術(shù)，修改了人類胚胎HBB基因的DNA，為治療地中海貧血癥提供了可能。該研究中一共使用了86個胚胎，48 h后有71個胚胎存活，其中在54個接受了基因測試的胚胎中僅有28個胚胎的基因被成功修改，但其中只有一小部分包含替代的遺傳物質(zhì)。該研究是史上第一例利用基因編輯技術(shù)改造人類胚胎細(xì)胞的案例。盡管該研究使用的胚胎均為無法發(fā)育成嬰兒、不能正常出生的胚胎，該成果的倫理問題在西方仍引發(fā)巨大爭議，由此《Nature》的記者和編輯們最終將黃軍就選入了年度十大人物之列[20]。多種肌肉營養(yǎng)障礙癥（duchenne muscular dystrophy，DMD）是表達(dá)dystrophin蛋白的基因發(fā)生移碼突變，導(dǎo)致不能形成有功能的抗肌萎縮蛋白dystrophin所引發(fā)的一種遺傳性疾病。2014年研究者已利用CRISPR技術(shù)成功修復(fù)了小鼠胚胎中的dystrophin基因缺陷。今年，西南醫(yī)學(xué)中心的Chengzu Long，杜克大學(xué)的Charles Gersbach，哈佛大學(xué)Amy Wagers 與MIT張鋒合作研究組這3個獨(dú)立的研究組又分別完成了小鼠成年體的基因修復(fù)。其中Chengzu Long研究組的研究方案為利用腺病毒將gRNA以及CRISPR/Cas9導(dǎo)入肌肉細(xì)胞，利用CRISPR/Cas9切除有缺陷的DN段，使小鼠能夠產(chǎn)生較短版本的有功能的dystrophin蛋白[21]。

逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)傳染病的治療方面：HIV病毒的基因會整合到病人的基因組上。利用抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療僅能抑制HIV病毒的復(fù)制但對整合在細(xì)胞中的病毒DNA不起作用，一旦停止服用藥物這些病毒余孽就會起死回生，開始產(chǎn)生艾滋病原體。因此只有清除整合在宿主靶細(xì)胞上的HIV病毒基因才能實(shí)現(xiàn)根治艾滋病的夢想。2013 年，朱煥章等設(shè)計并獲得了一對能特異靶向多數(shù)HIV亞型基因保守區(qū)LTR （long terminal repeat） 的ZFN，并證實(shí)該ZFN能特異性靶向HIV感染及潛伏細(xì)胞系上的HIV1前病毒LTR，且介導(dǎo)了HIV1整合基因的高效切除，畝獲得了顯著抗HIV感染的效果[22]。今年，Rafal等[23]利用CRISPR/Cas9技術(shù)使帶有HIV病毒的T細(xì)胞失去活性，同時病毒復(fù)制在受感染細(xì)胞中降低了90%。這一治療方案預(yù)計在兩三年后開展臨床試驗(yàn)。

22在新方法學(xué)及動物模型制備上的應(yīng)用當(dāng)前，各類基因敲除（knockout）和基因嵌入/置換（knockin）基因工程動物及細(xì)胞系已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)識疾病發(fā)生發(fā)展規(guī)律、研究疾病預(yù)防和治療的重要實(shí)驗(yàn)工具和手段。傳統(tǒng)的基因工程動物制備工藝――基因打靶技術(shù)是基于胚胎干細(xì)胞的一種同源重組技術(shù)。利用該技術(shù)制備基因修飾動物周期較長且存在生殖系統(tǒng)傳遞失敗的風(fēng)險。新型的基因編碼技術(shù)系統(tǒng)可在小鼠受精卵中直接進(jìn)行基因組編輯，因而快速、高效、低成本、無物種限制地一步生成基因工程動物。復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的研究人員通過CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行凝血因子Ⅸ（Factor Ⅸ，F(xiàn)Ⅸ）基因敲除，快速、高效地構(gòu)建血友病乙模型小鼠，以期為血友病乙的研究提供更加便捷的途徑[24]。Park 等[25]使用TALEN 技術(shù)將誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞中含有F8 基因的140 kb染色體片段倒置，建立了小鼠血友病A模型，并且再次通過TALEN基因編輯工具將其之前倒置的染色體片段再重新恢復(fù)到正常。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TALEN基因編輯工具既可以建立疾病模型，又可以介導(dǎo)疾病的再次糾正。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院的研究人員利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的同源重組，將有絲分裂降解結(jié)構(gòu)域MD（Mitosisspecial degradation domain，MD）插入到進(jìn)基因組表達(dá)框上游，以期周期性持續(xù)降解細(xì)胞內(nèi)CTCF（CCCTC binding factor，CTCF）蛋白，從而獲得CTCF蛋白特異性降解細(xì)胞系，為后續(xù)研究CTCF功能奠定基礎(chǔ)[26]。

此外，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，基因編輯技術(shù)已經(jīng)變?yōu)榭蒲腥藛T的新寵，越來越多的科學(xué)家運(yùn)用其與其他技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行各種學(xué)術(shù)研究。第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院和重慶大學(xué)的研究人員通過CRISPR/Cas9介導(dǎo)的同源重組修復(fù)方法，用GFP標(biāo)記HCC細(xì)胞中的內(nèi)源多功能性因子Nanog，證明雄激素/雄激素受體軸可以通過直接結(jié)合其啟動子，增加Nanog的表達(dá)，并促進(jìn)HCC細(xì)胞的干性和腫瘤發(fā)生[27]，從而初步闡明了肝癌發(fā)生的性別差異的機(jī)制。CRISPR/Cas9技術(shù)的成熟使得利用多重sgRNA載體高效、高通量編輯細(xì)胞內(nèi)基因成為可能，為新型功能遺傳篩選創(chuàng)造了條件。IAA2（indole acetic acid 2）是擬南芥Aux/IAA生長素響應(yīng)基因大家族中的一員。由于沒有該基因的失去功能型突變體，其功能和作用機(jī)制的研究受到了阻礙。研究人員在GoldenGate克隆技術(shù)的基礎(chǔ)上，將每3個sgRNA串聯(lián)到同一個入門載體中，再將入門載體與含Cas9表達(dá)框的目標(biāo)載體LR反應(yīng)，獲得最終的表達(dá)載體。結(jié)果表明，設(shè)計的6個sgRNA有4個發(fā)揮了作用，產(chǎn)生了堿基插入突變和大片段缺失突變等多種可遺傳的突變，所得到的突變體為后續(xù)的IAA2功能研究提供了良好的材料[28]。

23其他應(yīng)用前景目前，世界各地的實(shí)驗(yàn)室已將基因編輯技術(shù)應(yīng)用于生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域。

預(yù)防瘧疾：利用CRISPR/Cas9對蚊子的基因進(jìn)行改造，使其攜帶一種抗瘧疾的基因，從而對瘧原蟲產(chǎn)生抑制，進(jìn)而遏制瘧疾的傳播[29]。另一種改造為導(dǎo)入不孕基因，使瘧蚊滅絕[30]。

器官移植：利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，對豬胰島素基因進(jìn)行了無痕定點(diǎn)修飾，使豬胰島素基因編碼生產(chǎn)人胰島素，成功建立了完全分泌人胰島素的基因編輯豬。這為糖尿病人提供更為理想的臨床異種胰島移植供體。另外，有研究改造了豬肺基因以利于用于人體肺移植，以及去除了豬器官上的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（PERV）以防止移植器官帶來的病毒感染[31]。

生物制藥：北京蛋白質(zhì)組研究中心張普民教授及其研究團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9技術(shù)對豬受精卵的基因組進(jìn)行了基因編輯，在豬白蛋白的基因區(qū)域插入了人白蛋白的編碼DNA，使豬只產(chǎn)生人白蛋白而不產(chǎn)生豬白蛋白[32]。

農(nóng)業(yè)育種改良：利用CRISPR/Cas9技術(shù)幾年內(nèi)可實(shí)現(xiàn)至少50～100年才能完成的育種改良工作。圣保羅Recombinetics公司利用該技術(shù)培育出不會長角的牛，從而使牛無須經(jīng)歷被切去牛角的痛苦過程。目前該公司正致力于培育永遠(yuǎn)不需要被的豬。

滅絕物種復(fù)活：加州大學(xué)圣克魯斯分校Ben Novak將滅絕的候鴿的博物館標(biāo)本DNA與現(xiàn)存鴿子進(jìn)行序列比對，并嘗試對現(xiàn)存鴿子進(jìn)行基因改造，使這些鴿子變得更接近滅絕的候鴿。

3基因編碼技術(shù)的爭議與思考

基因編輯技術(shù)可謂當(dāng)今生命科學(xué)界炙手可熱的前沿科技。顧名思義，該技術(shù)能夠?qū)ψ罨镜倪z傳單位――基因直接進(jìn)行設(shè)計和修改，其意義和價值可想而知。這使得各大公司迅速加入到基因編輯的產(chǎn)業(yè)之中。2015年8月，比爾及梅林達(dá)?蓋茨基金會和谷歌風(fēng)投基金投資Editas醫(yī)藥公司1.2億美元；2015年10月杜邦與Caribou生物科學(xué)公司達(dá)成了合作協(xié)議，使用CrisprCas9技術(shù)來改進(jìn)農(nóng)作物（http：//wwwnaturecom/news/genomeediting7factsaboutarevolutionarytechnology118869）。中國基因編輯技術(shù)產(chǎn)業(yè)已走在世界的前列：在CRISPR技術(shù)數(shù)上中國僅次于美國，位居世界第2；目前50多家中國研究機(jī)構(gòu)已提交了基因編輯專利；勁嘉股份與黃軍就團(tuán)隊(duì)合作開展CRISPR技術(shù)治療地中海貧血在臨床應(yīng)用方面的研究。中泰證券的分析師認(rèn)為未來5年僅地中海貧血基因治療的國內(nèi)潛在市場空間超過500億元。與此同時，隨著基因編碼技術(shù)的不斷發(fā)展，CRISPR/Cas9系統(tǒng)相對前兩代技術(shù)效率提升了10倍以上，操作容易程度提升了100～1 000倍，構(gòu)建周期縮短至原來的1/12，成本由5 000美元降低至30美元，脫靶率依據(jù)最新技術(shù)已降低至目前檢測技術(shù)檢測不到的水平。脫靶率、效率、便攜性及成本的極大改善，使得該技術(shù)更平民化，技術(shù)門檻越來越低。它已成為許多車庫生物學(xué)家/草根生物學(xué)家以及生物黑客的新寵。都柏林生物黑客和企業(yè)家Andreas Stürmer說，CRISPR是有史以來最了不起的工具，可以在自己的家里玩（http：//wwwnaturecom/news/biohackersgearupforgenomeediting118236）。

但任何事物都有其雙面性，基因編輯技術(shù)產(chǎn)業(yè)雖然能夠造福于人類，然而上面所述的巨大的經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動以及越來越低的技術(shù)門檻，再加上人類對自身健康改良的迫切心態(tài)極可能導(dǎo)致對該技術(shù)的濫用，進(jìn)而對人類和地球環(huán)境形成威脅，甚至造成意想不到的生態(tài)災(zāi)難。在美國國家情報總監(jiān)詹姆斯?克拉珀的威脅評估報告中，“基因編輯”已經(jīng)被列入“大規(guī)模毀滅性武器和武器的擴(kuò)散”威脅名單，與核武器并列（https：//wwwtechnologyreviewcom/s/600774/topusintelligenceofficialcallsgeneeditingawmdthreat/）。因此，關(guān)于該技術(shù)運(yùn)用的爭議從其誕生之日就已出現(xiàn)，并呈愈演愈烈之勢?，F(xiàn)有爭議最集中之處為關(guān)于人類胚胎改造的倫理學(xué)爭議。史上第一、二例基因編輯技術(shù)改造人類胚胎細(xì)胞的研究皆出現(xiàn)在中國。2015年4月，中山大學(xué)黃軍就和他的團(tuán)隊(duì)利用CRISPRCas9基因編輯技術(shù)，為治療地中海貧血癥修改了人類胚胎基因組[33]。2016年4月29日廣州醫(yī)科大學(xué)范勇團(tuán)隊(duì)，宣布他們用基因編輯技術(shù)制造出一個能對艾滋病毒免疫的人類胚胎[34]。盡管這2例基因編輯研究都使用的是人類三核受精卵（不能正常發(fā)育的受精卵），但在國際上仍引起了廣泛的關(guān)注和全球科學(xué)家激烈的討論。討論的焦點(diǎn)不在于文章的學(xué)術(shù)價值，而在于改造人類胚胎細(xì)胞的倫理問題。由于基因編譯技術(shù)引發(fā)的倫理問題迫在眉睫，2015年12月1日，由美國國家科學(xué)院、美國國家醫(yī)學(xué)院、中國科W院和英國皇家學(xué)會聯(lián)合組織召集的人類基因組編輯國際峰會在華盛頓召開。會議重點(diǎn)了解各方對基因編輯技術(shù)的倫理問題的態(tài)度和想法。美國再生醫(yī)學(xué)聯(lián)盟主席蘭菲爾（Edward Lanphier）等在《Nature》雜志上發(fā)表評論文章稱，希望研究人員暫時不要對人類生殖細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，否則可能對后代產(chǎn)生無法預(yù)測的后果[35]。然而，人類胚胎改造的研究終究為大勢所趨。2016年2月1日，英國政府批準(zhǔn)了倫敦弗朗西斯?克里克研究所 Kathy Niakan研究員對人類胚胎進(jìn)行編輯的請求。這項(xiàng)研究成為世界首例獲國家監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的人類胚胎編輯研究。

綜上所述，日漸成熟的基因編輯技術(shù)已經(jīng)成為了強(qiáng)力的生物、醫(yī)學(xué)工具，在癌癥、遺傳性疾病和逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)的傳染病等疾病的治療方面帶了巨大的突破，可以快速構(gòu)建實(shí)驗(yàn)新方法和動物模型，推動科研的發(fā)展，并在器官移植、生物制藥、農(nóng)業(yè)育種改良、滅絕物種復(fù)活和中藥現(xiàn)代化等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。其價值甚至引起了普通民眾的廣泛關(guān)注。人類暢想將來它不僅可去除遺傳缺陷、治療疾病，還可導(dǎo)入長壽、健康、強(qiáng)力的基因，甚至制造完美人類。當(dāng)然，任何事物都是一把雙刃劍，在樂觀暢想基因編輯技術(shù)可使人類變得更加完美的同時，也不要忘記濫用技術(shù)可能帶來的潛在風(fēng)險和生態(tài)災(zāi)難。建立針對基因編輯技術(shù)安全有效的檢測手段，制定合理健全的法律道德制度，才能使這項(xiàng)技術(shù)更好地應(yīng)用和造福人類。

4基因編輯在中藥發(fā)展中的潛在前景

如何讓傳統(tǒng)中藥跟上生命科學(xué)現(xiàn)代化的步伐，使傳統(tǒng)中醫(yī)藥走出國門，讓世界接受中草藥，是當(dāng)今中醫(yī)藥工作者面臨的難題。長期以來，由于中醫(yī)藥與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)之間缺乏有效溝通的橋梁，有逐漸被邊緣化的趨勢。中藥基因組計劃將現(xiàn)代生命科學(xué)的最新技術(shù)和研究成果應(yīng)用于中藥研究，有望徹底改變中藥研究手段和方法的落后局面，架起傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)與現(xiàn)代生命科學(xué)之間溝通的橋梁。中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所陳士林團(tuán)隊(duì)在著名植物學(xué)雜志《Molecular Plant》發(fā)表丹參全基因組[36]，標(biāo)志著作為常用中藥丹參的遺傳密碼被破譯，為揭示丹參主要藥理活性成分丹參酮和丹參酚酸生物合成及其調(diào)控的分子機(jī)制，促進(jìn)丹參優(yōu)良品種選育提供了重要的遺傳背景基礎(chǔ)。該工作構(gòu)建了世界上首個藥用植物基因組框架圖，標(biāo)志著我國中藥研究進(jìn)入了基因組學(xué)時代。目前已有多個中草藥如印度大麻、赤靈芝、牛耳草、鐵皮石斛等完成了基因組測序。中草藥基因組研究的飛速發(fā)展為基因編輯技術(shù)在中草藥研究中的應(yīng)用帶來了極佳的時機(jī)和廣闊的前景。今后研究者們可以以丹參研究為模板，借鑒國外的植物基因組研究計劃的經(jīng)驗(yàn)，對中草藥在結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、功能基因組學(xué)和生物信息學(xué)等方向展開研究。在此基礎(chǔ)上，利用基因編輯技術(shù)開展中藥藥效成分、藥材的生長及抗性相關(guān)基因的研究和改造工作，結(jié)合先進(jìn)的育種方法，篩選出既保持“道地血統(tǒng)”，又優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗病的中藥材優(yōu)良品種。該工作既有利于實(shí)現(xiàn)中藥標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，使中藥質(zhì)量可控，又有利于解決當(dāng)前中藥材資源面臨的“斷糧”困境。

中藥藥材是現(xiàn)代藥物研發(fā)最大的遺傳信息資源之一。我國在該方面具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢?！侗静菥V目》中記載了1 892種藥用植物，1995年出版的《中華本草》收集了8 000多種藥用植物，而且其中不乏很多名貴，稀缺的藥材如人參，蟲草等。另有統(tǒng)計表明，我國中草藥已有12 000多種?；蚓庉嫾夹g(shù)的成熟也為開發(fā)這個藥物基因資源帶來了良機(jī)?；蚓庉嫾夹g(shù)在中藥資源的引入和應(yīng)用，將會為解決這一問題帶來新的前景。通過基因編輯技術(shù)可以快速獲得藥材靶基因的突變或是導(dǎo)入異源基因，從而快速鑒定出該基因產(chǎn)物與藥理活性成分的相關(guān)性和重要性，發(fā)掘出新的或更高效的藥物相關(guān)基因，并可更清晰地闡明藥理活性成分生物合成及其調(diào)控的分子機(jī)制。

盡管將基因編碼技術(shù)引入中藥研究能為傳統(tǒng)中草藥帶來新發(fā)展和突破，但與當(dāng)今各個領(lǐng)域廣泛應(yīng)用基因編碼技術(shù)相比，其在中藥研究中的應(yīng)用還處于起步階段，還有許多基礎(chǔ)工作有待完善。比如這一技術(shù)的應(yīng)用必須以完善的中藥基因資源為基礎(chǔ)，如果沒有對中藥特別是具有豐富藥理藥效學(xué)和臨床應(yīng)用價值的名貴中藥的基因資源的研究與開發(fā)，基因技術(shù)體系的應(yīng)用必然大打折扣。此外，也不能盲目的為了中藥的基因而基因，浪費(fèi)大量的人力物力資源，應(yīng)有的放矢的將目標(biāo)集中在既具有重要臨床應(yīng)用價值的名貴或?yàn)l臨滅絕的中藥基因資源的研究與應(yīng)用上，為中藥現(xiàn)代化搭建良好的基礎(chǔ)技術(shù)平臺，讓現(xiàn)代基因技術(shù)更好的為傳統(tǒng)中藥的發(fā)展服務(wù)。

[致x]李連達(dá)院士對本文的選題、框架設(shè)計等給予了諸多寶貴意見。

[參考文獻(xiàn)]

[1]季海艷，朱煥章.基因編輯技術(shù)在基因治療中的應(yīng)用進(jìn)展[J].生命科學(xué)，2015，27（1）：71.

[2]Bibikova M， Carroll D， Segal D， et al.Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage bychimeric nucleases[J].Mol Cell Biol， 2001， 21（1）：289.

[3]Smith J， Bibikova M， Whitby F G， et al Requirements for doublestrand cleavage by chimeric restriction enzymes with zinc finger DNArecognition domains[J].Nucleic Acids Res， 2000， 28（17）：3361.

[4]Terada R， JohzukaHisatomi Y， Saitoh M， et al Genetargeting by homologous recombination as a biotechnological tool for rice functional genomics[J].Plant Physiol， 2007， 144（2）：846.

[5]Yamauchi T， JohzukaHisatomi Y， FukadaTanaka S， et al.Homologous recombinationmediated knockin targeting of the MET1a gene for a maintenance DNA methyltransferase reproducibly reveals dosagedependent spatiotemporal gene expression in rice[J].Plant J， 2009， 60（2）：386.

[6]Zhang F， Maeder M L， UngerWallace E， et al High frequency targeted mutagenesis in Arabidopsis thaliana using zinc finger nucleases[J].Proc Natl Acad Sci USA， 2010， 107（26）：12028.

[7]Wright D A， Townsend J A， Winfrey R J， et al High frequency homologous recombination in plants mediatedby zincfinger nucleases[J].Plant J， 2005， 44（4）：693.

[8]Sonoda E， Hochegger H， Saberi A， et al Differential usage of nonhomologous endjoining and homologous recombination in double strand break repair[J] DNA Repair：Amst， 2006， 5（9/10）：1021.

[9]Rémy S， Tesson L， Ménoret S， et al Zincfinger nucleases：a powerful tool for genetic engineering of animals[J].Transgenic Res， 2010， 19（3）：363

[10]Liu Q， Segal D J， Ghiara J B， et al Design of polydactylzincfinger proteins for unique addressing within complex genomes[J].Proc Natl Acad Sci USA， 1997， 94（11）：5525.

[11]Beerli R R， Segal D J， Dreier B， et al.Toward controlling gene expression at will：specific regulation of the erbB2/HER2 promoter by using polydactyl zinc finger proteins constructed from modular building blocks[J].Proc Natl Acad Sci USA， 1995（25）：14628.

[12]Mussolino C， Cathomen T TALE nucleases：tailored genome engineering made easy[J].Curr Opin Biotechnol， 2012， 23（5）：644.

[13]Mahfouz M M， Li L， Fang X， et al.De novoengineered transcription activatorlike effector （TALE） hybrid nuclease with novel DNA binding specificity creates doublestrand breaks[J].Proc Natl Acad Sci USA， 2011， 108（6）：2623.

[14]Deng D， Yan C， Pan X， et al Structural basis for sequence specific recognition of DNA by TAL effectors[J] Science， 2012， 335（6069）：720.

[15]Zhang J， Rouillon C， Kerou M， et al Structure and mechanism of the CMR complex for CRISPR mediated antiviral immunity[J].Mol Cell， 2012， 45（13）：303.

[16]Wiedenheft B， Sternberg S H， Doudna J A RNAguided genetic silencing systems in bacteria and archaea[J] Nature， 2012， 482（7385）：331.

[17]Li W， Li X， Li T， et al Genetic modification and screening in rat using haploid embryonic stem cells[J].Cell Stem Cell， 2014， 14（3）：404.

[18]Flotte Terence R.Human gene therapy[J].November， 2015， 26（11）：iv.

[19]E Gibney The science to look out for in 2016[J] Nature， 2015， 529（7584）：14.

[20]Liang Puping， Xu Yanwen， Zhang Xiya， et al CRISPR/Cas9mediated gene editing in human tripronuclear zygotes[J] Protein Cell， 2015， 6（5）：363.

[21]Christopher E Nelson， Chady H Hakim， David G Ousterout， et al.In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy[J].Science， 2016， 351（6271）：400.

[22]Qu X， Wang P， Ding D， et al.Zincfingernucleases mediate specific and efficient excision of HIV1 proviral DNA from infected and latently infected human T cells[J].Nucleic Acids Res， 2013， 41（16）：7771.

[23]Rafal Kaminski， Yilan Chen， Tracy Fischer， et al Elimination of HIV1 genomes from human Tlymphoid cells by CRISPR/Cas9 gene editing[J].Sci Rep， 2016， 6：28213.

[24]汪⒑玻懷聰，孫瑞林，等.利用CRISPR/Cas系統(tǒng)快速高效構(gòu)建血友病乙小鼠模型[J].遺傳， 2015， 37（11）：1143.

[25]Park C Y， Kim J， Kweon J， et al.Targeted inversion and reversion of the blood coagulation factor 8 gene in human iPS cells using TALENs[J].Proc Natl Acad Sci USA， 2014， 111（25）：9253.

[26]Xie Dejian， Shi Minglei， Zhang Yan， et al.Construction of CTCF degradation cell line by CRISPR/Cas9 mediated genome editing[J].Hereditas， 2016， 38（7）：651.

[27]Jiang Lupin， Shan Juanjuan， Shen Junjie， et al Androgen/androgen receptor axis maintains and promotes cancer cell stemness through direct activation of nanog transcription in hepatocellular carcinoma[J].Oncotarget， 2016， 7（24）：36814.

[28]Liu Dingyuan， Qiu Ting， Ding Xiaohui， et al Rapid construction of multiple sgRNA vectors and high efficient knockout of Arabidopsis IAA2 gene using the CRISPR/Cas9 genomic editing technology[J].Hereditas， 2016， 38（8）：756.

[29]Rafael D Mesquitaa， Raquel J VionetteAmaralc， Carl Lowenbergerd， et al.Genome of Rhodnius prolixus， an insect vector of Chagas disease， reveals unique adaptations to hematophagy and parasite infection[J].Proc Natl Acad Sci USA，2015， 112（48）：14936.

[30]Andrew Hammond， Roberto Galizi， Kyros Kyrou， et al.A CRISPRCas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae[J].Nature Biotechnol， 2016， 34：78.

[31]Yang Y， Wang K， Wu H， et al.Genetically humanized pigs exclusively expressing human insulin are generated through custom endonucleasemediated seamless engineering[J].J Mol Cell Biol， 2016， 8（2）：174.

[32]Peng Jin， Wang Yong， Jiang Junyi， et al Production of human albumin in pigs through CRISPR/Cas9mediated knockin of human cDNA into swine albumin locus in the zygotes[J].Scientific Rep， 2015，5：16705.

[33]Liang P，Xu Y， Zhang X，et al.CRISPR/Cas9mediated gene editing in human tripronuclear zygotes[J] Protein Cell， 2015， 6：363.

篇9

【關(guān)鍵詞】 快速成型；膝關(guān)節(jié)模型；CT；DICOM

【Abstract】 This paper has reviewed the clinical practice situation in medical science about rapid prototyping technology. Described rapid prototyping technology general step and clinical practice situation that the ankle bone rolls over . Getting CT image picture of the whole knee joint with spiral CT， it is 1.0mm to scan one slice of intervals. Use DICOM file as the data source and get two-dimensional CT image of the knee joint through the relevant software. Using figure software edit and get shin bone fracture border of knee joint then export the border curve to CAD system and set up the three-dimensional model and export STL file again from CAD system； Paper base model that the ankle bone converts into tibi outside adopting the laser rapid prototyping machine of Model ZSW-I-A and processing STL file into the shin bone. Have used this paper base model on clinically and have got comparatively ideal results.

【Key words】 rapid prototyping；knee joint model；CT；DICOM

快速成型技術(shù)是將計算機(jī)輔助設(shè)計CAD，計算機(jī)輔助制造CAM，計算機(jī)數(shù)字控制CNC，激光，精密伺服驅(qū)動系統(tǒng)和新材料等先進(jìn)技術(shù)集于一體，依照計算機(jī)上構(gòu)成的產(chǎn)品三維設(shè)計模型，對其進(jìn)行分層切片，得到各層截面的輪廓。按照這些輪廓，激光束選擇地切割一層一層的紙基（或固化一層層的液態(tài)樹脂、燒結(jié)一層層的粉末塑料），或噴射源選擇地噴射一層層的粘結(jié)劑或熱熔材料等，形成各截面輪廓，并逐步疊加成三維產(chǎn)品，從而獲得所需的模型或產(chǎn)品的方法［1］。人膝關(guān)節(jié)是人體最主要也是最重要的關(guān)節(jié)之一。由于其在臨床醫(yī)學(xué)、康復(fù)工程、生物機(jī)械工程等領(lǐng)域的重要研究價值和應(yīng)用前景，長期以來吸引了大量的生物力學(xué)研究者投入對其的研究［2～6］。利用精確的物理模型可直接用于膝關(guān)節(jié)的移植和矯形手術(shù)，可以以原型為模具，用傳統(tǒng)方法做替代膝關(guān)節(jié)或矯形器械；另一方面可采用生物活性或生物兼容性材料制成的原型直接植入人體，與合金制品相比，具有更好的生物兼容性。其具體的優(yōu)點(diǎn)是生產(chǎn)周期短；人工骨與被代替骨形基本一致，有利于保持與原有其他器官的匹配；人工骨內(nèi)部具有微孔結(jié)構(gòu)，組織液和骨細(xì)胞容易長入，促進(jìn)修復(fù)過程；在人工骨內(nèi)部有骨因子，可使人工骨很快與人體微循環(huán)組織連通［7，8］。

1 三維模型的重建

制作膝關(guān)節(jié)模型的技術(shù)工作流程是：三維重建原型加工快速模具膝關(guān)節(jié)模型澆注后處理（見圖1）。

2.2 假體工程 膝關(guān)節(jié)模型的制作可以為臨床醫(yī)學(xué)中的“量身定做”問題的解決提供較為有效的解決方法和制作手段，適用于整形外科和假體工程，將RP和CT、MRI技術(shù)結(jié)合能輔助外科醫(yī)生迅速準(zhǔn)確地實(shí)施復(fù)雜外科手術(shù)，制作膝關(guān)節(jié)修復(fù)體，輔助正畸等。運(yùn)用膝關(guān)節(jié)模型，設(shè)計師可以根據(jù)特定病人的CT或MRI數(shù)據(jù)而不是標(biāo)準(zhǔn)的解剖學(xué)幾何數(shù)據(jù)來設(shè)計并制作種植體，這樣就極大地減少了種植體設(shè)計的出錯空間，并且這種適合每個病人解剖結(jié)構(gòu)的種植體確實(shí)能設(shè)計一個更好的手術(shù)結(jié)果。能制作出與病人完美配合的種植體，這一點(diǎn)可幫助外科醫(yī)生大大縮短手術(shù)操作的時間。這不但讓病人減少了麻醉時間，還能減少費(fèi)用。由于有了解剖模型，醫(yī)生可以有效地與病人溝通，借助于病人自己的解剖模型，可以指出關(guān)鍵的區(qū)域，從而增加病人的理解。

3 結(jié)論

通過快速原型加工的脛骨骨折紙基模型在臨床的應(yīng)用研究，可以得到如下結(jié)論：（1）以DICOM文件為數(shù)據(jù)源的三維建模方法可以得到比較準(zhǔn)確的膝關(guān)節(jié)三維模型。（2）將膝關(guān)節(jié)紙基模型用于診斷和手術(shù)可以大大縮短手術(shù)時間，提高手術(shù)的質(zhì)量，增加手術(shù)成功率。（3）膝關(guān)節(jié)紙基模型為母?？梢灾谱鞒雠c患者膝關(guān)節(jié)面匹配良好的修復(fù)假體。

4 展望

隨著基礎(chǔ)科學(xué)研究和邊緣學(xué)科研究的進(jìn)展，骨科的臨床實(shí)踐正在發(fā)生明顯的改變。特別是基因研究的深入，將來可以通過功能基因組學(xué)等技術(shù)早期診斷疾病從而及早采取預(yù)防措施。骨科疾病的基因治療目前多限于動物模型，但是已有多項(xiàng)關(guān)節(jié)炎臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行之中［10～12］。納米技術(shù)的發(fā)展為仿生材料的臨床應(yīng)用創(chuàng)造了條件［13］。在不久的將來，金屬及塑料材料的應(yīng)用將會減少，取而代之的是有細(xì)胞活性的生物材料［7，8］?，F(xiàn)在，快速成型的技術(shù)正朝著精密化、高精度、標(biāo)準(zhǔn)化、低成本等方向發(fā)展，并且可以實(shí)現(xiàn)真正意義上的綠色制造［14］。采用生物材料作為原材料直接成型的個性化假體將是RP技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的發(fā)展趨勢。

1 王運(yùn)贛.快速成型技術(shù).武漢：華中理工大學(xué)出版社，1999，1-3.

2 王臻，膝勇，李滌塵，等.基于快速成型的個體化人工半膝關(guān)節(jié)的研制-計算機(jī)輔助設(shè)計與制造.中國修復(fù)重建外科雜志，2004，18(5)：347-351.

3 張虎，李滌塵，孫明林，等.定制化單側(cè)膝關(guān)節(jié)假體設(shè)計與快速制造方法研究.北京生物醫(yī)學(xué)工程，2003，22(4)：266-268；273.

4 趙濤，翁磊，尤玉華，等.膝關(guān)節(jié)外傷性骨軟骨骨折的X線和MRI表現(xiàn).中華放射學(xué)雜志，2003，37(11)：985-988.

5 于群，肖學(xué)宏.膝關(guān)節(jié)磁共振成像的理論序列：3DFT-Volume-FFE.現(xiàn)代醫(yī)用影像學(xué)，1998，7(1)：3-6.

6 滕勇，王臻，李迪塵，等.快速成型的個體化人工半膝關(guān)節(jié)的研制—股骨髁的三維建模.中國修復(fù)重建外科雜志，2004，18(4)：257-260.

7 吳永輝，李滌塵，盧秉恒，等.基于RP的生物活性仿生制造研究.中國機(jī)械工程，2000，11(10)：1090-1093.

8 郭俠， 王廣春.快速成型技術(shù)及其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用.山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版) ，2003，41(5)：573-574；578.

9 嚴(yán)繼康，史慶南，常敏，等.快速成型技術(shù)在股骨頭壞死的臨床應(yīng)用研究：快速成型與快速制造.2004，3.第三屆全國快速成型與快速制造技術(shù)學(xué)術(shù)會議論文集，312-315.

轉(zhuǎn)貼于

10 詹子睿，邵增務(wù).骨關(guān)節(jié)炎基因治療進(jìn)展.中國中醫(yī)骨傷科雜志，2004，12(3)：57-59.

11 張洪斌.骨關(guān)節(jié)炎的基因治療.中國臨床康復(fù)，2003，7(32)：4390-4391.

篇10

[中圖分類號]R978[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1673-7210（2007）11（a）-028-03

乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)性肝炎是嚴(yán)重危害人民健康的常見傳染病。自1964年被發(fā)現(xiàn)后的40多年里，它成為了無數(shù)人揮之不去的陰影。全世界乙肝病毒表面抗原(HBsAg)陽性者約4億人，主要分布于亞洲、非洲和拉丁美洲地區(qū)[1]。據(jù)統(tǒng)計，全球每年約有100萬人死于HBV感染相關(guān)性疾病，占疾病死亡原因的第9位[2]。我國HBsAg陽性者約有1.2億人，其中3 000萬人為慢性乙肝患者[3,4]。如何預(yù)防和有效治療肝炎成為當(dāng)今重要的醫(yī)學(xué)課題?，F(xiàn)將目前常用的治療乙型肝炎的現(xiàn)代藥物及臨床應(yīng)用作一綜述，供醫(yī)患參考。

1 生物類藥物

1.1 干擾素-α

IFN-α結(jié)合于其特異的細(xì)胞表面受體，誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)多種廣譜的抗病毒蛋白，包括蛋白激酶A(protein kinase A , PKA)、2'，5'-寡腺苷酸合成酶(2'，5'-oligoadenylate synthetase, OAS)、脫氨酶(adenosine deaminase, ADAR) 和Mx蛋白等。PKA可被細(xì)胞內(nèi)病毒RNA激活, 隨后使翻譯起始因子-2α(eukaryoteinitiation factor-2α,eIF-2α)磷酸化而失去活性，從而阻止病毒mRNA的翻譯，使病毒蛋白合成起始受阻；OAS在細(xì)胞內(nèi)被病毒單鏈RNA激活，合成寡腺苷酸，繼而激活細(xì)胞內(nèi)RNA酶L，病毒RNA降解；ADAR可催化病毒雙鏈RNA中的腺嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)榇吸S嘌呤，從而使病毒解聚。Mx蛋白是一類蛋白家族，可影響細(xì)胞內(nèi)病毒核殼體的轉(zhuǎn)運(yùn)及RNA的合成[7]。此外，IFN-α通過免疫機(jī)制抗HBV[8]。對HBeAg陽性患者的療效, IFN-α治療3~6個月，停藥6~12個月后，HBeAg轉(zhuǎn)陰率為33%，血清HBV DNA轉(zhuǎn)陰率為37%，HBsAg轉(zhuǎn)陰率為8%。對于HBeAg轉(zhuǎn)陰的患者，其療效一般會長期維持。有研究表明，HBeAg轉(zhuǎn)陰患者中80%~90%在4~8年內(nèi)其HBeAg持續(xù)陰性[9]。長期的臨床隨訪(7~10年)研究表明，IFN-α治療可顯著改善HBeAg轉(zhuǎn)陰患者的預(yù)后，其肝硬化并發(fā)癥及肝移植發(fā)生率顯著降低，累積生存率顯著提高[10]。目前，臨床試驗(yàn)又應(yīng)用新一代的聚乙二醇-IFN-α(PEG-IFN-α)治療乙型肝炎，并取得了不錯的療效[11]。

HBeAg陰性的CHB患者，其體內(nèi)感染的HBV DNA的前核心區(qū)發(fā)生了突變，從而不能表達(dá)HBeAg。這類患者對IFN-α的反應(yīng)性比HBeAg陽性患者差，有報道顯示，以HBV-DNA轉(zhuǎn)陰和轉(zhuǎn)氨酶水平恢復(fù)正常為標(biāo)準(zhǔn)，其IFN-α治療的長期有效率僅為15%~18%[12]。對HBeAg陰性患者采用IFN-α治療24個月，治療結(jié)束21個月后，其有效率為30%。HBeAg陰性患者IFN-α治療后，持續(xù)應(yīng)答者發(fā)生肝硬化及其并發(fā)癥的幾率和死亡率與治療無效，治療后復(fù)發(fā)與未治療者相比明顯降低[13]。

1.2 胸腺肽α1

胸腺肽α1(thymosin alpha-1, Tα1,Zadaxin)是20世紀(jì)70年代末期從胸腺素第5組分(TF5)中分離純化出的一種小分子生物活性多肽。Tα1分子含28個氨基酸, 廣泛存在于機(jī)體的胸腺上皮細(xì)胞、外周血、大腦、垂體、、濾泡液和羊水中。Tα1在機(jī)體免疫應(yīng)答過程中充當(dāng)十分重要的角色，其抗HBV的作用機(jī)制尚未明確，目前認(rèn)為可能和增強(qiáng)T細(xì)胞及NK細(xì)胞應(yīng)答功能及增強(qiáng)IL-2及IFN產(chǎn)生有關(guān)。

Chan HL[14]等實(shí)驗(yàn)證明，胸腺肽組與安慰劑組相比治療結(jié)束，治療結(jié)束后6個月、12個月生物化學(xué)反應(yīng)無差異。結(jié)論認(rèn)為，對于慢性乙型肝炎病毒感染胸腺肽能有效抑制病毒復(fù)制，但此影響延遲直至停止治療后12個月?，F(xiàn)有劑型為注射劑，療程6個月，基本和干擾素相似，無任何副作用。胸腺肽α1還可以作為疫苗輔助藥來加強(qiáng)乙肝疫苗的效果，其作用特點(diǎn)表現(xiàn)為延遲效應(yīng)。在治療結(jié)束時對胸腺肽α1的效應(yīng)率很低，但隨訪觀察中完全效應(yīng)的病例逐漸增加。單用胸腺肽α1治療的效應(yīng)率不高，主張與其他抗乙肝病毒藥物聯(lián)合應(yīng)用。

2 化學(xué)類藥物核苷類似物

2.1 拉米夫定(lamivudine,3TC)

拉米夫定是新型核苷類藥物，全稱2',3-二脫氧-3-硫代胞嘧啶(3TC)。其進(jìn)人細(xì)胞后，磷酸化為三磷酸拉米夫定而發(fā)揮作用。拉米夫定作用的靶位是HBV聚合酶反轉(zhuǎn)錄活性YMDD(酪氨酸、蛋氨酸、門冬氨酸)基序。在HBV復(fù)制周期中，HBV侵入細(xì)胞內(nèi)，其核心部分進(jìn)入胞核，部分雙鏈的環(huán)狀DNA分子轉(zhuǎn)變成超螺旋共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)，然后合成前基因組RNA，再以此為模板在HBV聚合酶作用下反轉(zhuǎn)錄負(fù)鏈DNA，最后復(fù)制成部分雙鏈的環(huán)狀DNA，HBV聚合酶的抑制將抑制前基因組RNA反轉(zhuǎn)錄為負(fù)鏈DNA，阻斷新合成HBV-DNA的鏈化，從而抑制HBV的復(fù)制。 拉米夫定可快速高效抑制HBV-DNA復(fù)制。香港、臺灣等地的雙盲、安慰劑對照研究[15]發(fā)現(xiàn)，每天100 mg拉米夫定口服治療2周，病人血HBV-DNA比基礎(chǔ)值下降97%。每天100 mg拉米夫定治療52周和安慰劑的HBV-DNA陰轉(zhuǎn)率(

拉米夫定特異性抑制HBV聚合酶反轉(zhuǎn)錄活性部位，故毒性極低。迄今為止的臨床試驗(yàn)中不良反應(yīng)的發(fā)生率及嚴(yán)重程度和安慰劑組相比無顯著性差異，試驗(yàn)病人耐受良好。在臨床前動物實(shí)驗(yàn)中，使用大于臨床治療劑量幾十和幾百倍的拉米夫定對大鼠、貓和狗的主要器官無毒性。拉米夫定治療中存在的問題：停藥后反跳，膽紅素升高。長期拉米夫定治療，隨著敏感株迅速被抑制，耐藥株會逐漸出現(xiàn)。對拉米夫定耐藥的HBV突變主要是HBV聚合酶C區(qū)的酶活性區(qū)YMDD基序的變異，其中蛋氨酸(M)被纈氨酸(V)或異亮氨酸(I)替代。YMDD突變株的復(fù)制能力低于野生株[17]，因此，繼續(xù)應(yīng)用拉米夫定，HBV-DNA的回升往往低于治療前的水平，一般不出現(xiàn)臨床病情加重或惡化。

2.2 阿德福韋(adefovir)

阿德福韋酯在體內(nèi)迅速完全代謝為母體藥物阿德福韋，在細(xì)胞激酶作用下磷酸化為活性代謝產(chǎn)物二磷酸鹽-PMEApp，此產(chǎn)物與酶的自然底物三磷酸脫氧腺苷(dATP)競爭，抑制HBV-DNA聚合酶(HBV逆轉(zhuǎn)錄酶)或通過整合到病毒DNA鏈后使其發(fā)生鏈終止；PMEA本身也可直接整合到HBV-DNA鏈中，形成DNA鏈終結(jié)子[18]，使HBV-DNA鏈停止復(fù)制，因而它具有較強(qiáng)的抑制HBV-DNA復(fù)制的作用。在為期48周的隨機(jī)、雙盲、安慰劑對照臨床試驗(yàn)(序號分別為437及438)中阿德福韋口服劑量為10 mg/d (n=700)[19,20]。試驗(yàn)結(jié)果表明，437研究中治療組與對照組發(fā)現(xiàn)肝活檢病理改善率分別為53%和25%，血清HBV-DNA對數(shù)值分別下降lg(3.57±1.64)和lg(0.98±1.32)，ALT正常率分別為48%和16%。438研究中治療組與對照組發(fā)生肝活檢病理改善率分別為64%和35%，血清HBV-DNA對數(shù)值分別下降lg(3.65±1.41)和lg(1.32±1.25)，ALT正常率分別為72%和29%。HBeAg陰轉(zhuǎn)率在437研究中分別為12%和6%，繼續(xù)給藥阿德福韋至72周，在此期間HBV-DNA下降程度同前48周的治療期相同。同時437研究中ALT正常率增加，肝移植病人的臨床試驗(yàn)中也取得相似療效。雖然拉米夫定是抑制HBV的有效的核苷類似物，但在長期應(yīng)用之后，病人經(jīng)常出現(xiàn)耐藥性，并且隨用藥時間的延長發(fā)生耐藥性的比例增加，導(dǎo)致其療效明顯降低[22]。阿德福韋對于拉米夫定耐藥病毒株有顯著的抑制作用[23]。在迄今為止的實(shí)驗(yàn)中，阿德福韋顯示了良好的安全性及有效性。

2.3 恩替卡韋(entecavir)

恩地卡韋為新型碳環(huán)2-脫氧鳥苷，在體內(nèi)在磷酸激酶的作用下形成活性的三磷酸化合物，拮抗HBV所需要天然底物脫氧鳥苷三磷酸（dGTP），在細(xì)胞內(nèi)作用半衰期為15 h，在人體內(nèi)不被肝細(xì)胞代謝，主要從腎臟排出。恩地卡韋的作用靶點(diǎn)為HBV的逆轉(zhuǎn)錄酶，可以在所有3個環(huán)節(jié)抑制HBV逆轉(zhuǎn)錄酶活性，包括堿基引導(dǎo)（base priming）、從mRNA前體反轉(zhuǎn)錄成負(fù)鏈以及HBV-DNA正鏈合成。

在體外HBV-DNA轉(zhuǎn)染的HepG32細(xì)胞的藥物抗HBV實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，它是現(xiàn)有抗HBV核苷類似物中作用最強(qiáng)的一種。其抗HBV作用大于LAM 1 000倍，并可降低肝組織中cccDNA量和病毒抗原量。不但對野毒株具有顯著抑制作用，而且對基因突變株也具有同樣的抑制作用，并且對拉米夫定、泛昔洛韋的耐藥病毒株仍然敏感。美國FDA公布的資料表明[24]，對于核苷類似物處治者，無論HBeAg陰性還是陽性，治療48周后，恩地卡韋治療組患者的組織學(xué)改善比率均顯著高于拉米夫定對照組；HBV-DNA較基線的降低幅度以及血清ALT復(fù)常率，實(shí)驗(yàn)組均顯著優(yōu)于對照組[25]。Wong等[26]對Ⅲ期臨床研究組的部分病例進(jìn)行了肝細(xì)胞內(nèi)HBVcccDNA的檢測，初步結(jié)果顯示治療48周后恩地卡韋降低肝細(xì)胞內(nèi)HBVcccDNA的作用強(qiáng)于拉米夫定。國內(nèi)外對恩地卡韋的臨床研究結(jié)果相似，在未經(jīng)抗病毒治療的患者中，總的不良時間發(fā)生率為：恩地卡韋0.1 mg組45%、恩地卡韋0.5 mg組40%，安慰劑組42%，無1例發(fā)生藥物相關(guān)的不良事件[27]。

基本適應(yīng)證為有HBV活動性復(fù)制和血清學(xué)或肝組織學(xué)炎癥指標(biāo)的成年慢性乙肝患者。其療程在1年以上，目前對停藥指征尚無明確規(guī)定。治療期間和停藥后密切監(jiān)察和隨訪[28]。

2.4 其他

其他抗HBV病毒的核苷類似藥物還有泛昔洛韋( famcictovir)、利巴韋林(ribavirin) 、阿糖腺苷(Ara-A)、單磷酸阿糖腺苷(Ara-AMP)，它們通過作用HBV復(fù)制不同的階段來抑制病毒。在臨床驗(yàn)證的核苷類似物新品種還有替諾卡韋(tenofovir）、特必夫定(telbivuding)、克來夫定(clevudine)和恩曲他濱(emtricitabine)等，它們比拉米夫定有相同或更高的抗病毒效果，而且對拉米夫定耐藥株有效。

3 免疫調(diào)節(jié)藥物

3.1 胸腺因子D

胸腺因子D 對HepG2.2.15細(xì)胞分泌的HBsAg和HBeAg有劑量依賴的抑制作用。對HBsAg的抑制效果要優(yōu)于對照藥物IFNα-2b，對HBeAg的抑制效果要略低于對照藥物IFNα-2b?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白gp90或它的N-末端片段注入乙肝患者，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)免疫應(yīng)答加強(qiáng)，顯示其可能通過增加CTL免疫應(yīng)答增加機(jī)體抗乙肝病毒和原發(fā)性肝癌的能力[29]。

3.2 樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)疫苗

樹突狀細(xì)胞作為抗原提呈細(xì)胞在激發(fā)抗病毒免疫應(yīng)答中起著重要的作用。利用HBV特異蛋白在體外預(yù)先制備的DC而制成的自體疫苗可望成為未來的治療方法[30]。

4 其他藥物

抗肝炎病毒基因治療的藥物或策略包括反義技術(shù)、核酶、基因免疫、干擾肽或蛋白質(zhì)、負(fù)性突變體、單鏈抗體、RNAi等目前正在研發(fā)之中。

5 結(jié)語與展望

抗病毒治療的成敗是慢性肝炎能否治愈的關(guān)鍵，由于乙肝病毒進(jìn)入肝細(xì)胞后產(chǎn)生的cccDNA對各種藥物的耐藥性，細(xì)胞核內(nèi)的cccDNA難以清除，造成停藥后，病毒復(fù)制的反彈以及長期藥物治療所導(dǎo)致的乙肝病毒突變株的產(chǎn)生，使得到目前為止，對HBV的治療尚沒有一種特效的藥物能夠達(dá)到滿意的治療效果。

隨著分子生物學(xué)和重組DNA技術(shù)的迅速發(fā)展，基因治療及基因疫苗的進(jìn)一步研制，清除HBV，徹底治療慢性乙肝將成為一種可能，但總的說來，HBV基因治療的研究仍有相當(dāng)長的路要走。盡管HBV基因治療困難重重，但基因技術(shù)仍為HBV治療帶來了新的希望，通過廣大學(xué)者不懈的努力，相信在不久的將來會取得一定的突破。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Mc Mahon BJ. Selecting appropriate management strategies for chronic hepatitis B: who to treat[J].Am J Gastroenterology, 2006, 101(S): 7.

[2]Mohamadnejad M, Alekzadeh R, Hepatitis B. Type B hepatitis[J].N Eng J Med, 2004, 350(26):2719.

[3]孫偉, 李靜, 李亞娟.慢性肝炎治療藥物新進(jìn)展[J].中國藥房,2002, 13(5): 308.

[4]Maddrey WC.Hepatitis B:An important public health issue[J]. J Med Virol, 2000, 6(1): 362-366.

[5]駱抗先. 乙型肝炎基礎(chǔ)和臨床[M].第2版.北京：科學(xué)出版社，1997.

[6]Yeh CT, Chi HT, Chu CM, et al. GI phase dependent nuclear localization of relaxed circular hepatitis B virus DNA and aphidicolin induced accumulation of covalently closed circular DNA[J]. J Med Virol, 1998, 55(1): 42.

[7]Samuel CE. Antiviral actions of interferons[J]. Clin Microbiol Rev, 2001, 14(4): 778-809.

[8]Tang TJ, Kwekkeboom J, Mancham S, et al. Intrahepatic CD8+ tlymphocyte response is important for therapy induced viral clearance in chronic hepatitis B infection[J]. J Hepatol,2005, 43(1): 45-52.

[9]Manns MP. Current state of interferion therapy in the treatment of chronic hepatitis B[J]. Semin Liver Dis, 2002, 22(11): 7-13.

[10]Angus P, Vaughan R, Xiong S, et al. Resistance to adefovir dipivoxil therapy associated with development of a novel mutation in the HBV polymerase[J]. Gastroenterology, 2003, 125(2): 292-297.

[11]Cooksley WG, Piratvisuth T, Lee SD, et al.Peginterferon alpha-2a (40kDa): an advance in the treatment of hepatitis B eantigen positivechronic hepatitis B[J]. J Viral Hepat, 2003, 10(4): 298-305.

[12]Brunetto MR, Oliveri F, Coco B, et al.Outcome of anti-HBe positive chronic hepatitis B in alpha- interferon treated and untreated patients: a long term cohort study[J]. J Hepatol, 2002, 36 (2):263-270.

[13]Papatheodoridis GV, Manesis E, Hadziyannis SJ. The long-term outcome of interferon-α treated and untreated patients with HBeAg-negative chronic hepatitis B[J]. J Hepatol, 2001, 34(2): 306-313.

[14]Chan HL, Tang JL, Tam W, et al. The efficacy of thymosin in the treatment of chronic hepatitis B virus infection: a meta 2 analysis[J].Aliment Pharmacol Ther, 2001, 15(12): 1899-1905.

[15]Lai CL, Chien RN, Jeung NWY, et al. A one-year trial of lamivudine for chronic hepatitis B[J]. N Eng 1 Med, 1998, 33(9): 61.

[16]Sokal E, Roberts EA, Mieli-Vergani G, et al. Dose-finding and safety of lamivudine in children and adolescents with chronic hepatitis B[J]. Hepetology,1998,28(42): 489.

[17]Niesterm HGM, Honkoop P, Hangama EB, et al. Idenification of more than one mutation in the hepatitis B virus polymerase gene arising during prolonged lamivudine treatment[J]. J Infect Dis, 1998,1377-1382.

[18]Wolters LM, Niesters HG, De Man RA, et al. Nucleo-side analogues for chronic hepatitis B[J]. Eur J Gastroenterol Hepatol, 2001, 13 (12): 1499-1506.

[19]Marcell in P, Chang TT, Lim SG,et al. Adefovir dipivoxil for the treatment of hepatitis Be antigen-positive chronic hepatitis B[J]. N Engl J Med, 2003, 348 (9): 808-816.

[20]Hadziyannis SJ, Tassopoulos NC, Heathcote EJ, et al. Adefovir dipivoxil for the treatment of hepatitis Be antigen 2 negative chronic hepatitis B[J]. N Engl J Med , 2003, 348 (9): 800-807.

[21]Yang H, Westland CE, Del aney WE 4th, et al. Resistance surveillance in chronic hepatitis B patients treated with adefovir dipivoxil for up to 60 weeks[J]. Hepatology, 2002, 36 (2): 464-473.

[22]Perrillo R, Schiff E, Yoshida E, et al. Adefovir dipivolxil for the treatment of lamivudine resistant hepatitis B mutants Hepatology[J]. 2000, 32 (1): 129-134.

[23]Delaney WE 4th,Edwards R，Coll edge D, et al.Cross resistance testing of antihepadnaviral compounds using novel recombinant baculoviruses which encode drug-resistant strains of hepatitis B virus[J].Antimicrob Agents Chemother, 2001, 45(6):1705-1713.

[24]Cheng TT, Gish RG, Hsdziyannis SJ,et al.A dose-ranging study of the efficacy and tolerability of entecavir in lamivudine-refractory chronic hepatitis B patients[J]. Gastroenterology, 2005, 129:1198-1209.

[25]US Food and Drug Administration.Drug Approval Package Entecavir[Z]. July 12,2005.

[26]Wong DK, Yuen M, Ngai V, et al. One year treatment of enlecavir results in reduction in intrahepatic covalently closed circular DNA level. Abstract of 56th annual meeting of the American association for the study of liver diseases (AASLD)[G]. 2005, San Francisco, California, USA.

[27]姚光弼，張定鳳，王寶恩，等. 恩地卡韋抗乙型肝炎病毒劑量和療效的研究[J].中華肝臟病雜志, 2005, 13: 484-487.

[28]姚光弼. 慢性乙型肝炎長期抗病毒治療的目標(biāo)和策略[J].中華傳染病雜志，2005, 2(3): 710.