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篇1

The biological activity and antitumor effect against　lymphoma cells in DCCIK cells

ABSTRACT: Objective To investigate the proliferation activities， phenotype changes， level of secretory cytokines and antitumor activity against lymphoma cells of DCCIK cells in coculture of cytokineinduced killer (CIK) cells with dendritic cells (DC). Methods DC and CIK were prepared from healthy human peripheral blood mononuclear cells. They were cocultured peripherally. CIK cells were cultured alone as controls. Increased number of cells were counted by tapanblue staining， killing activity was detected by MTT assay， cells phenotypes were analyzed by flow cytometry， secretions of INFγ and IL12 were determined by ELISA. Results The proliferation activity of DCCIK cells was significantly higher than that of CIK cells (P

KEY WORDS: cytokineinduced killer cell; dendritic cellscytokine induced killer cell; biological activity; antilymphoma

細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokineinduced killer cells， CIK)是一種體外增殖能力強、殺瘤活性高及對多重耐藥腫瘤細胞較敏感的廣譜抗瘤免疫活性細胞[1]。樹突狀細胞(dendritic cells， DC)是目前已知的功能最強的抗原遞呈細胞，可以在體內(nèi)、外向T淋巴細胞遞呈抗原，并誘發(fā)細胞毒T淋巴細胞反應[2]。在本研究中，我們通過多種細胞因子組合從正常人外周血中誘導DC、CIK細胞，并將兩者共培養(yǎng)，觀察DCCIK細胞體外增殖能力、殺傷活性、免疫表型變化及分泌細胞因子水平，旨在為其臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 rhIL2、RPMI 1640培養(yǎng)基及四甲偶氮唑鹽(MTT)均為Sigma公司產(chǎn)品，培養(yǎng)用CD3McAb由Neomarkers公司提供，rhIL1、rhIFNγ、rhTNFα為上海生物制品研究所產(chǎn)品，rhGMCSF為先靈葆雅公司惠贈，rhIL4購自Gibco BRL公司，流式細胞儀標記抗體CD3、CD3CD4、CD3CD8、CD3CD56及檢測細胞因子(IL12、IFNγ)的ELISA試劑盒均購自晶美生物工程有限公司，鼠抗人CD1a、CD14、HLADR和FITC兔抗鼠熒光二抗購自中國醫(yī)學科學院天津血液學研究所。

1.2 靶細胞來源 Raji為人組織淋巴瘤細胞株，引自上海第二醫(yī)科大學瑞金醫(yī)院血液學研究所；新鮮淋巴瘤細胞取自外科手術切除的淋巴瘤標本(淋巴結(jié)或脾臟)，去除結(jié)締組織和壞死組織，剪成1mm3的組織塊，2.5g/L的胰酶消化后過100鋼目，經(jīng)淋巴細胞分離液分離，獲得惡性淋巴瘤細胞(malignant lymphoma cells， MLC)，存于液氮中待用。要求靶細胞比例>95%，活體細胞>90%。

1.3 CIK細胞的培養(yǎng)擴增 采集健康人外周血，肝素抗凝，以FicollHypaque淋巴細胞分離液分離獲得單個核細胞(MNC)，RPMI 1640洗3次，調(diào)細胞密度為4×106/mL；貼壁培養(yǎng)1-2h，收集懸浮細胞用含10%(體積分數(shù))小牛血清(FSC)的RPMI 1640液調(diào)細胞密度為1×106/mL，第0天加入rhIFNγ1000u/mL，放置37℃，5%(體積分數(shù))CO2孵育箱中培養(yǎng)24h后加入rhIL2300u/mL、rhIL1100u/mL、CD3McAb 50μg/L，繼續(xù)培養(yǎng)，以后每3d更換新鮮培養(yǎng)液，補加rhIL2。

1.4 DC的體外培養(yǎng) 參照文獻方法[3]。獲得健康人外周血MNC中的貼壁細胞，用含10%(體積分數(shù))FSC的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，其中包含rhGMCSF 550u/mL，rhIL4500u/mL。隔日半量換液，補加細胞因子，收獲前72h再加入rhTNFα 50u/mL，誘導DC成熟。

1.5 DCCIK細胞的培養(yǎng) 收獲培養(yǎng)第9天的DC細胞及CIK細胞經(jīng)活細胞計數(shù)后按1∶5混合培養(yǎng)，第3天和第6天，收集細胞做生物學活性測定。

1.6 細胞毒活性的測定 以不同效靶比(5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1)，把效應細胞和靶細胞放入96孔板，另設單獨靶細胞及效應細胞孔，每孔設3個復孔，置37℃，5%(體積分數(shù))CO2孵育箱中培養(yǎng)48h，按本室建立的MTT法[4]測殺傷活性。殺傷活性(%)=[1-(實驗組A-效應組A)/靶細胞A]×100%。

1.7 細胞免疫表型的分析 用流式細胞儀檢測CIK及DCCIK細胞的免疫表型；間接免疫熒光法測定DC免疫表型。

1.8 細胞因子的檢測 收集培養(yǎng)細胞上清液進行IL12、IFNγ水平測定。采用ELISA雙抗夾心法，操作按試劑盒說明。

1.9 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗，以P

2 結(jié)果

2.1 增殖能力的觀察 CIK細胞培養(yǎng)第6天進入顯著增殖期，部分細胞體積明顯增大，成叢或集落狀懸浮生長。與DC共培養(yǎng)可明顯提高CIK細胞增殖速率。培養(yǎng)第15天，經(jīng)臺盼藍排斥法活細胞計數(shù)，CIK細胞總數(shù)擴增到原來的(43.57±5.11)倍，而DCCIK細胞為(60.75±4.89)倍，兩組差異有統(tǒng)計學意義(P

圖1 培養(yǎng)時間與增殖倍數(shù)的關系（略）

Fig.1 The relationship between the culture time and proliferation fold

2.2 細胞表型的分析

2.2.1 DC的形態(tài)及表型檢測 培養(yǎng)第9天的DC 細胞在倒置顯微鏡下可觀察到典型的樹狀或毛刺狀突起。檢測細胞表面分子表達，其特異性標志CD1a的陽性率為(80.56±1.72)%，MHCI類分子HLADR的陽性率為(92.06±3.20)%，CD14的表達率為(8.69±1.76)%。表明此種方法可以誘導較高純度的成熟DC。

2.2.2 DC與CIK細胞共培養(yǎng)后的免疫表型 CIK細胞單獨培養(yǎng)，隨著培養(yǎng)時間的延長，CD3+CD8+及CD3+CD56+細胞的比例逐漸增加。與DC共培養(yǎng)的CIK細胞CD3+CD8+及CD3+CD56+雙陽性細胞的比例明顯高于同條件下未共培養(yǎng)組(P

2.3 體外細胞毒性 共培養(yǎng)3d的DCCIK細胞，對Raji細胞株及新鮮MLC的殺傷活性均明顯高于單純CIK細胞(P

表1 CIK和DCCIK細胞免疫表型的變化（略）

Table 1 The phenotype changes of CIK and DCCIK cells

*P

表2 DC CIK細胞對淋巴瘤細胞的殺傷活性（略）

Table 2 Killing activity of DCCIK cells on MLC and cell line Raji

2.4 細胞因子的測定 DC與CIK細胞共培養(yǎng)3d，其上清液中IFNγ、IL12的水平分別為(438.02±213.17)ng/L和(30.65±9.10)ng/L，而同條件下，CIK細胞組IFNγ為(213.96±137.00)ng/L，IL12為(10.10±0.35)ng/L，兩組相比，DCCIK細胞分泌IFNγ、IL12的水平顯著高于CIK細胞(P

3 討論

CIK細胞是由多種細胞因子如IL2、IFNγ和CD3單克隆抗體等誘導的一種免疫活性細胞，其兼有T淋巴細胞強大的抗瘤活性與NK細胞的非主要組織相容性復合物(MHC)限制性殺瘤特點[5]。DC攝取、加工、處理抗原，高表達MHCI、MHCⅡ類分子、共刺激分子及黏附分子，在體內(nèi)外具有激發(fā)初次和繼發(fā)性T細胞免疫應答功能，并能分泌Th1型細胞因子IL12，誘導T細胞和NK細胞產(chǎn)生IFNγ和增強激活NK細胞的細胞毒活性。為此，將具有高效殺瘤活性的CIK細胞和具有強大腫瘤抗原遞呈能力的DC共培養(yǎng)，無疑會起到一定的抗腫瘤協(xié)同作用。研究發(fā)現(xiàn)DC刺激CIK細胞后，細胞毒活性顯著增強[6]。本實驗顯示DC、CIK細胞一起培養(yǎng)后，共培養(yǎng)物DCCIK細胞對淋巴瘤細胞的殺傷作用顯著高于同條件下單純CIK細胞。雖然與文獻報道[67]有關DCCIK細胞來源、制備方法、效靶比、效靶細胞作用時間以及靶細胞種類不盡相同，但DCCIK細胞對淋巴瘤細胞的殺傷活性與文獻中DCCIK細胞對胰腺癌細胞DANG及CML細胞的殺傷活性強于CIK細胞的結(jié)論相同。證實DCCIK細胞確實具有比CIK細胞更強的抗腫瘤活性。CIK細胞屬于異質(zhì)細胞群，其抗腫瘤作用與CD3+CD8+、CD3+CD56+雙陽性細胞及分泌細胞因子的水平密切相關。將DC、CIK細胞一起培養(yǎng)后，兩者所分泌的細胞因子及表面分子表達發(fā)生了變化。研究發(fā)現(xiàn)DC與CIK細胞共培養(yǎng)時，DC成熟表面標志CD86、CD80、CD40、HLADR的表達增加[8]。而CD4+CD25+細胞(調(diào)節(jié)細胞T細胞)和IL10水平下降，對腫瘤細胞的細胞毒活性增強[9]。負載CA199(腫瘤相關抗原)的DC與CIK細胞混合培養(yǎng)24h后IL12的分泌量為CIK細胞單獨培養(yǎng)時6.93倍[7]。DC的抗原提呈作用能使CIK細胞分泌IFNγ的時間延長，分泌量增加[10]。我們的實驗顯示，共培養(yǎng)條件下，DCCIK細胞上清液中IL12、IFNγ分泌量均比同條件下單純CIK細胞培養(yǎng)分泌高，且CD3+CD8+、CD3+CD56+雙陽性細胞比例也比CIK細胞組顯著增多。說明DCCIK細胞的高殺傷活性與大量增殖的CD3+CD8+、CD3+CD56+細胞有關，細胞因子IL12、INFγ對殺傷腫瘤也發(fā)揮了直接和間接的重要作用。DC能夠激活CIK細胞增殖。與DC共培養(yǎng)14d后CIK細胞的增殖倍數(shù)比共培養(yǎng)7d時高出兩倍左右[7]。本研究結(jié)果表明，共培養(yǎng)DCCIK細胞不僅具有很強的殺瘤活性，且比同源CIK細胞具有更強的增殖速率，共培養(yǎng)6d，DCCIK細胞總數(shù)比單獨培養(yǎng)CIK細胞總數(shù)多擴增了17倍。說明利用共培養(yǎng)條件可提高CIK細胞的增殖能力，獲得大量高效的免疫細胞，這對于腫瘤臨床具有重要意義。本研究初步證實，DCCIK細胞增殖活性、抗淋巴瘤作用均高于單純CIK細胞，這為其臨床應用治療或輔助治療淋巴瘤提供了實驗和理論依據(jù)。

基金項目：陜西省“三五人才工程”專項基金資助項目

【參考文獻】

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篇2

Anti-proliferation Effect of Phosphorylated Chrysin Derivatives in Leukemia Cells/FU Yun-bi，LIU Zhi-he，PENG Ai-yun.//Medical Innovation of China，2015，12（16）：120-123

【Abstract】 Objective：To investigate the anti-proliferation effect of a series new phosphorylated chrysin derivatives in leukemia cells.Method：The cell viability of the 12 phosphorylated chrysin derivatives in Kasumi-1 cells was detected by MTT assay，and the derivatives with higher proliferation inhibition rate than chrysin were selected out to process the next step to verify the anti-proliferation effect in K562 cells，HL60 cells，U937 cells，and bone marrow mononuclear cells （BMMNC） from acute leukemia patients.Result：Chrysin derivatives 3c and 7a could inhibit the proliferation of leukemia cells in vitro.Conclusion：The new phosphorylated chrysin derivatives 3c and 7a have potential value in anti-leukemia research.

【Key words】 Chrysin； Leukemia； Proliferation inhibition

First-author’s address：The 4th Hospital Affiliated to Medicine College of Ji’nan University，Guangzhou 510220，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.16.044

黃酮類化合物廣泛存在于自然界的某些植物和漿果中，是藥用植物中的主要活性成分之一，亦是人類飲食中的重要組成部分。黃酮類化合物以其廣譜的藥理作用尤其是抗腫瘤作用引人矚目[1-3]。近年來世界上掀起了黃酮類化合物開發(fā)的熱潮。白楊素（chrysin）是被廣泛研究的黃酮類化合物之一，其來源于紫葳科植物木蝴蝶的種子、莖皮，松科植物山白松的心木，芒松的心木等，在蜂膠中的含量較高，是蜂膠的主要有效成分。白楊素的化學名為5，7-二羥基黃酮。研究證明，白楊素具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗高血壓、抗糖尿病、抗菌、抗過敏等多種藥理作用[4]。本研究旨在探討新合成的一類膦（磷）?；讞钏匮苌镌隗w外對白血病細胞的增殖抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 Kasumi-1細胞株、K562細胞株、HL60細胞株、Jurkat細胞株、NB4細胞株及U937細胞株購中國科學院上海細胞庫，白楊素含膦（磷）衍生物由中山大學化學與化學工程學院彭愛云提供。PRMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，新生牛血清從杭州四季青生物工程材料有限公司購買，甲基亞砜（DMSO）購自美國Amresco公司。

1.2 白楊素含膦（磷）衍生物的合成 以白楊素為先導化合物，按步驟1和步驟2所示的合成路線（圖1），經(jīng)膦（磷）?；Y(jié)構(gòu)修飾后合成新的系列白楊素含膦（磷）衍生物。結(jié)構(gòu)經(jīng)核磁、紅外、質(zhì)譜等確證，純度經(jīng)高效液相色譜鑒定?；衔锖铣捎芍猩酱髮W化學與化學工程學院合成。

1.3 細胞培養(yǎng)及原代細胞分離 細胞株用含10%小牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，加1×105 U/L青霉素、1×105 U/L鏈霉素，在37 ℃、95%飽和濕度和5% CO2條件下培養(yǎng)，1～2 d換液1次。

選取根據(jù)MIC分型診斷為急性白血病的初診患者，抽取骨髓5 mL，分離單個核細胞（BMMNCs）。共分離10例急性白血病患者的BMMNCs。

1.4 MTT實驗 取指數(shù)生長期細胞或BMMNCs，實驗在96孔培養(yǎng)板中進行，每孔加入100 μL細胞懸液（2×104個細胞），100 μL用培養(yǎng)基稀釋的藥物。白楊素為陽性對照組、設溶媒對照組及調(diào)零組，每組3孔，培養(yǎng)一定時間后，實驗組及對照組每孔加入20 μL MTT液（5 g/L），調(diào)零組加入無血清PRMI-1640培養(yǎng)基，混勻，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，離心去清液，每孔加入100 μL DMSO溶液，EX-800型酶標儀以450 nm波長測定OD值，計算相對細胞活力，細胞活力（%）=實驗組OD值/對照組OD值×100%，重復3次實驗。

圖1 白楊素含膦（磷）衍生物的合成

1.5 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 11.5軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料數(shù)據(jù)以（x±s）表示，采用t檢驗，P

2 結(jié)果

2.1 白楊素含膦（磷）衍生物的結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì) 合成了12個白楊素膦酸單酯（3aC3l），6個白楊素膦酸（4aC4f），1個白楊素膦（磷）酸6和2個白楊素膦（磷）酸單酯7a，7b，共21個化合物。結(jié)構(gòu)見圖2。該類化合物是未見文獻報道的新化合物，其構(gòu)效關系顯示有更強的抗腫瘤活性、較好的水溶性、更高的生物利用度，其結(jié)構(gòu)經(jīng)核磁、紅外、質(zhì)譜等確證，純度經(jīng)高效液相色譜鑒定，均達到99.5%以上，溶解度經(jīng)高效液相色譜法測定為52.3-138.6 μm。

圖2 白楊素含膦（磷）衍生物

2.2 白楊素含膦（磷）衍生物對Kasumi-1細胞增殖抑制活性篩選 為了篩選出增殖抑制活性較強的化合物，參照文獻[5]報道先導化合物――白楊素抑制細胞活性的有效濃度，并以其作為陽性對照，12個化合物分別以100 μm作用細胞48 h，MTT試驗檢測細胞活性。結(jié)果見表1，衍生物3c、3e、3j、4b、7a、7b對Kasumi-1細胞有一定的增殖抑制活性。其中衍生物3c、7b對細胞的抑制活性遠遠高于先導化合物白楊素，比較差異有統(tǒng)計學意義（P

表1 白楊素膦（磷）酸衍生物對Kasumi-1細胞的增殖抑制率

化合物 增殖抑制率（%） 化合物 增殖抑制率（%）

3a 0.52±12.6 3l 3.19±13.43

3b -5.68±9.52 4a 16.40±13.17

3c 82.64±4.08 4b 36.09±6.48

3d 7.83±7.81 4c 9.25±17.13

3e 46.36±15.96 4d 1.74±6.39

3f 1.62±5.71 4e 0.08±8.64

3g 10.46±13.19 4f -6.99±13.36

3h 15.24±19.41 6 9.09±8.93

3i 16.42±7.95 7a 79.23±5.01

3j 42.89±7.93 7b 31.97±14.61

3k 8.07±14.65 Chrysin 47.39±6.03

以白楊素（chrysin）為對照，100 μm的3c、7a分別作用Kasumi-1細胞0、12、24、36、48、60 h，結(jié)果見圖3。100 μm的3c作用36 h細胞活性最低，100 μm的7a作用48 h細胞活性最低。衍生物3c、7a對Kasumi-1細胞增殖抑制活性呈時間依賴性，且均強于白楊素，比較差異有統(tǒng)計學意義（P

圖3 白楊素含膦（磷）衍生物3c、7a對Kasumi-1細胞增殖抑制的時效關系曲線

2.3 白楊素含膦（磷）衍生物3c、7a對多個白血病細胞株的增殖抑制活性 為了探討衍生物3c、7a對其他白血病細胞株的活性，選用衍生物3c、7a對Kasumi-1細胞株有效作用時間及濃度，分別作用于Jurkat細胞株、NB4細胞株、K562細胞株、HL60細胞株及U937細胞株，MTT法檢測細胞活性。結(jié)果見圖5、圖6。衍生物3c、7a對以上細胞株的增殖均有明顯的抑制作用，且呈時間及濃度依賴性。與對照組比較，作用時間48 h時，25 μm衍生物3c即對U937細胞產(chǎn)生明顯的增殖抑制作用；50 μm濃度時對Jurkat細胞株、NB4細胞株、K562細胞株及HL60細胞株有明顯的增殖抑制作用，差異具有統(tǒng)計學意義（P

2.4 白楊素含膦（磷）衍生物3c、7a對AML患者BMMNCs的增殖抑制作用 10例初診的急性白血病，其中M2a 4例，M5 1例，B-ALL 2例，T-ALL 2例，慢粒急變1例，分離骨髓單個核細胞，用不同濃度的白楊素含膦（磷）衍生物3c或7a處理48 h，取10例患者各濃度的OD值平均數(shù)做曲線，結(jié)果見圖7。與細胞株結(jié)果類似，衍生物3c及7a對急性白血病患者的骨髓原代細胞均有明顯的增殖抑制作用，且為濃度依賴性。

3 討論

許多研究者對從植物中篩選出的天然黃酮類化合物（如葛根總黃酮、姜黃素、金蓮花黃酮、染料木黃酮等）進行了廣泛研究，發(fā)現(xiàn)其在體內(nèi)外對多種白血病細胞均有一定的活性[6-7]，但是天然黃酮存在活性偏低、類藥性差等缺點。為了提高其抗腫瘤活性，適應臨床應用，各種各樣的黃酮衍生物被合成[8-9]。文獻報道最成熟的為國外研究者合成的Flavopiridol（夫拉平度，黃酮 L86-8275），Ⅰ期或Ⅱ期臨床試驗已證實此藥單用或與其他化療藥物合用對難治復發(fā)性急性或慢性白血病均有肯定療效[6，10]。

圖5 白楊素含膦（磷）衍生物3c對各細胞株的增殖抑制活性

注：A：0、25、50、75、100 μm的3c作用各細胞株48 h；B：100 μm的3c、作用各細胞株0、12、24、36、48、60 h

圖6 白楊素含膦（磷）衍生物7a對各細胞株的增殖抑制活性

注：A：0、25、50、75、100 μ的7a作用各細胞株48 h；B：100 μm的7a、作用各個細胞株0、12、24、36、48、60 h

近年來許多國內(nèi)外學者對白楊素衍生物的合成方法和生理活性進行了研究，對白楊素進行硝化、烷基化、羥甲基化、氟甲基化、膦（磷）?；蠛铣傻牟糠盅苌锞哂休^強的抗腫瘤活性，在體外對許多腫瘤細胞都有明顯的增殖抑制作用，如人胃癌SGC-7901 細胞、人肺癌A549 細胞、人肝癌HepG2細胞及HepB3細胞、人宮頸癌HeLa細胞、人鼻咽癌CNE-2細胞、人結(jié)腸癌（HT-29）細胞、人類小細胞肺癌NCI2H446細胞、人急性粒細胞性白血病HL-60細胞、人急性T淋巴細胞白血病Jurkat 細胞、急性白血?。∕5）U937細胞等[5，11-13]。白楊素膦（磷）?；Y(jié)構(gòu)修飾的報道較少，陳曉嵐等[14]對白楊素進行了含膦（磷）改造，共合成出4種新的化合物，他們的研究結(jié)果表明，白楊素含膦（磷）衍生物與溶菌酶具有更強的親和力。張婷等[15]合成了白楊素四乙基二膦（磷）酸酯，并發(fā)現(xiàn)白楊素和白楊素四乙基二膦（磷）酸酯對宮頸癌Hela細胞軟瓊脂的集落形成有明顯抑制作用，能誘導并促進宮頸癌Hela細胞發(fā)生分化，且白楊素四乙基二膦（磷）酸酯在作用效果方面較白楊素明顯，該研究提示膦（磷）酸基團的添加增強了抗腫瘤活性。

筆者通過化學法，將膦酸或膦（磷）酸基團引入到白楊素側(cè)鏈中，新合成21個未見文獻報道的白楊素含膦（磷）衍生物。這些白楊素含膦（磷）衍生物具備以下優(yōu)點：（1）它們較白楊素具有更好的水溶性。預期在體內(nèi)能較好的被吸收，可以彌補大多數(shù)天然黃酮因水溶性較差而導致生物利用率低的不足。（2）含膦（磷）基團是一些抗骨質(zhì)疏松、抗病毒、抗腫瘤等藥物分子的藥效團，白楊素又具有廣泛生物活性，所合成的白楊素含膦（磷）衍生物應用了藥效團拼合原理，可能具有更好的藥理活性。通過體外細胞增殖抑制試驗，從新合成的白楊素含膦（磷）衍生物中篩選出對急性白血?。∕2）細胞株Kasumi-1增殖抑制作用較強的2個衍生物（3c、7a），這兩個化合物100 μm濃度作用48 h對白血病細胞的增殖抑制率分別為82.64%、79.23%，白楊素同等條件下對白血病細胞的抑制率為47.39%。此后，用衍生物3c及7a分別處理多個細胞株及急性白血病患者的骨髓原代細胞，發(fā)現(xiàn)，白楊素含膦（磷）衍生物3c及7a對檢測的多個白血病細胞株及患者骨髓原代細胞均有明顯的增值抑制作用，說明該兩個衍生物有體外抗白血病活性，有進一步進行體內(nèi)抗腫瘤活性研究的價值。

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篇3

【關鍵詞】 巨噬細胞; γ射線; LPS; S100A8

巨噬細胞在整個免疫反應中起極為重要的作用， 輻射后許多組織和器官損傷都涉及到巨噬細胞的功能異常， 巨噬細胞的輻射效應一直受到重視。巨噬細胞通常具有輻射抗性， 但已有多篇報道證明電離輻射能夠促進或直接激活巨噬細胞。一氧化氮（nitric oxide， NO）的生成是巨噬細胞被激活的重要標志， 單純的射線不能引起小鼠巨噬細胞J774.1和RAW264.7細胞中NO水平的改變， 但0.5～10 Gy 射線預處理能夠觸發(fā)這些巨噬細胞為干擾素γ（interferonγ， IFNγ）和（或）脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）誘導生成NO， 而且呈現(xiàn)劑量效應關系［1］。

鈣結(jié)合蛋白S100A8是S100蛋白家族成員， 是一個多功能分子， 其最主要的功能是參與免疫炎癥反應過程［2］。Stassen等［3］研究發(fā)現(xiàn)， 6 Gy X射線照射MCF7細胞后48～72 h， S100A8被誘導表達， 其 mRNA水平呈現(xiàn)輻射劑量效應關系。靜息態(tài)的巨噬細胞不表達S100A8， 激活狀態(tài)的巨噬細胞才表達S100A8分子， S100A8在巨噬細胞中為LPS等炎癥因子誘導表達［4］。既然S100A8能夠為電離輻射及LPS誘導表達， 那么我們需要進一步研究在巨噬細胞中， 電離輻射是否與LPS協(xié)同誘導S100A8以及S100A8的表達與巨噬細胞功能狀態(tài)之間的關系。本研究觀察比較了RAW264.7細胞受10 Gy γ射線照射后24 h， 5 mg/L LPS繼續(xù)處理24 h與正常對照、 相應單純γ射線或單純LPS處理組細胞形態(tài)、 周期、 活性氧介質(zhì)（reactive oxygen intermediates， ROI）水平、 NO水平及S100A8 mRNA等指標的改變并探討相互之間的關系。

1 材料和方法

1.1 材料 試劑LPS、 2’7’二氯熒光素雙醋酸鹽(2， 7dichlorofluorescin dictate， DCFHDA)、 碘化丙啶(propidium iodide， PI)為美國Sigma公司產(chǎn)品。RPMI1640培養(yǎng)基干粉、 胎牛血清、 TRIzol試劑為美國Invitrogen公司產(chǎn)品。隨機引物、 MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶為美國Promega公司產(chǎn)品。BioEasy SYBR Green I Real Time PCR Kit為杭州博日公司產(chǎn)品。FACS Calibur 流式細胞儀為美國BD公司產(chǎn)品。Linegene熒光定量PCR檢測系統(tǒng)為杭州博日公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 RAW264.7細胞培養(yǎng)及處理 小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞于含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液， 37℃、 50 mL/L CO2飽和度條件下培養(yǎng)。對數(shù)增殖期細胞照射前24 h， 換新鮮培養(yǎng)基， 不輻射或10 Gy 60Co γ射線照射， 照射后24 h， 不加或加入5 mg/L LPS， 繼續(xù)培養(yǎng)24 h。相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化。

1.2.2 流式細胞術測定細胞周期 乙醇固定骨髓單細胞懸液， PI染色， 流式細胞儀檢測， 具體按文獻［5］進行。

1.2.3 流式細胞術測定ROI水平 約1×106 RAW264.7細胞鋪種于6孔板中， 培養(yǎng)過夜， γ射線或(和)LPS處理后不同時間收集細胞， 用無血清RPMI1640培養(yǎng)液洗2遍細胞后， 20 μmol/L DCFHDA懸浮細胞， 37℃孵育30 min， 無血清RPMI1640培養(yǎng)液洗滌1遍后， 0.5 mL無血清RPMI1640培養(yǎng)液懸浮細胞， 流式細胞儀檢測。

1.2.4 NO水平檢測 通過Griess顏色反應測定細胞培養(yǎng)上清中NO-2水平， NO-2水平以吸光值A550表示， 具體方法參照文獻［1］進行。

1.2.5 實時定量RTPCR檢測S100A8表達 用 TRIzol試劑提取RAW264.7細胞總RNA， 經(jīng)紫外分光儀檢測A260和A280， 測定濃度和純度。取總RNA 2 μg， 隨機引物0.5 μg， M MLV逆轉(zhuǎn)錄酶200 U， 進行25 μL體系反轉(zhuǎn)錄。每PCR反應取2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模版， 加入BioEasy SYBR Green I Real Time PCR Kit試劑， 于熒光定量PCR檢測系統(tǒng)進行實時定量PCR擴增測定CT（Treshhold cycle）值。小鼠S100A8上游引物5′ATCACCATGCCCTCTACAAGA3′， 下游引物5′TGCTACTCCTTGTGGCTGTCT3′。看家基因3磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase， GAPDH）上游引物5′CCATGGAGAAGGCCGGGG3′， 下游引物5′CAAAGTTGTCATGGATGACC3′。用比較CT方法， 以看家基因GAPDH為內(nèi)參， 以未處理正常細胞中S100A8 mRNA水平為1， 相對定量γ射線或(和)LPS處理后S100A8 mRNA的表達水平。相對表達倍數(shù)=2^(-CT)， 其中CT=γ射線或(和)LPS處理樣品的CT -正常對照的CT， CT=S100A8的CT-GAPDH的CT 。

1.2.6 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)均以x±s表示， 應用SAS9.13統(tǒng)計軟件進行兩因素析因設計資料的方差分析。

2 結(jié)果

2.1 RAW264.7細胞形態(tài)學改變 觀察比較RAW264.7細胞受10 Gy γ射線照射后24 h， 5mg/L LPS繼續(xù)處理24 h與正常對照、 相應單純γ射線或單純LPS處理組細胞形態(tài)學變化， 可見正常RAW264.7細胞為圓形， 貼壁生長; 單純γ射線或單純 LPS處理的細胞變大， 部分細胞伸出偽足、 呈梭形， 胞內(nèi)顆粒增多， 兩種處理細胞形態(tài)學改變類似; γ射線與 LPS共同作用的細胞變得更大， 胞內(nèi)大量顆粒物， 巨噬細胞呈現(xiàn)被激活狀態(tài)。

2.2 RAW264.7細胞倍性、 凋亡的改變 正常未處理的RAW264.7細胞中非整倍性（aneuploid）細胞、 凋亡細胞百分數(shù)均為0%; 10 Gy γ射線照射后24 h， 5 mg/L LPS繼續(xù)處理24 h及相應單純γ射線或單純LPS處理條件下， 細胞均出現(xiàn)部分非整倍性細胞; 而只在γ射線與LPS共同作用條件下， 細胞才出現(xiàn)明顯凋亡（圖1）。

2.3 RAW264.7細胞胞內(nèi)ROI水平的改變 觀察10 Gy γ射線照射后0～24 h胞內(nèi)ROI水平的動態(tài)變化， 照后即刻開始升高， 6 h達高峰， 24 h基本恢復到正常水平（圖2）， 可見胞內(nèi)ROI早期生成明顯， 隨后下降， 因此我們比較細胞受各種處理后6 h， 胞內(nèi)ROI水平的改變。單純10 Gy γ射線照射后30 h（即10 Gy γ射線照射后24 h， 0 mg/L LPS繼續(xù)處理6 h）， 胞內(nèi)ROI水平不變; 單純5 mg/L LPS處理后6 h（即0 Gy γ射線照射后24 h， 5mg/L LPS繼續(xù)處理6 h）， 胞內(nèi)ROI水平升高; 10 Gy γ射線照射后24 h， 5 mg/L LPS繼續(xù)處理6 h， 胞內(nèi)ROI水平明顯升高， 從測定數(shù)值看， 明顯高于單純5 mg/L LPS處理后6 h或單純10 Gy γ射線照射后胞內(nèi)ROI的水平（圖3， 圖2）。圖2 10 Gy γ射線照射后0～24 h胞內(nèi)ROI水平的變化

2.4 RAW264.7細胞NO水平的變化 單純γ射線照射， 胞內(nèi)NO水平不變; 單純LPS處理條件下， 與正常對照相比， 胞內(nèi)NO水平升高; 10 Gy γ射線照射后24 h， 5 mg/L LPS繼續(xù)處理24 h， 胞內(nèi)NO水平明顯升高， 而且高于單純LPS處理組， 表明γ 射線能夠促進LPS增強巨噬細胞RAW264.7中NO水平（圖4）。

2.5 RAW264.7細胞中S100A8 分子mRNA表達水平的改變 實時定量RTPCR方法檢測胞內(nèi)S100A8 mRNA水平的變化。以未處理正常細胞中S100A8 mRNA水平為1， 單純10 Gy γ射線處理條件下， 胞內(nèi)S100A8 mRNA水平為9.0±2.3; 單純5 mg/L LPS處理條件下， 胞內(nèi)S100A8 mRNA水平為86.0±8.3; 10 Gy γ射線與5 mg/L LPS共同作用條件下， 胞內(nèi)S100A8 mRNA水平為630.0±70.8?？梢?， γ射線、 LPS均可誘導巨噬細胞RAW264.7中S100A8 mRNA表達， LPS的作用強于γ射線， 而且γ 射線與LPS具有協(xié)同作用。

3 討論

我們的研究表明， RAW264.7細胞受10 Gy γ射線照射后24 h， 5 mg/L LPS繼續(xù)處理24 h條件下， γ射線與LPS共同作用影響細胞多方面的生物學效應， 具體表現(xiàn)為細胞體積明顯變大， 胞內(nèi)大量顆粒物， 呈現(xiàn)被激活狀態(tài); 部分細胞呈現(xiàn)非整倍性， 少量細胞出現(xiàn)凋亡; 胞內(nèi)ROI水平、 NO水平明顯升高; S100A8 分子mRNA水平明顯升高， 而且這些效應幾乎都比γ射線或LPS單因素的作用要強。

γ射線與LPS共同作用使RAW264.7細胞形態(tài)改變， 胞內(nèi)大量顆粒物的出現(xiàn)可能反應了細胞酶活性的改變。我們檢測了RAW264.7細胞受0～40 Gy γ射線照射后0～72 h細胞倍性、 周期、 凋亡的改變， 發(fā)現(xiàn)隨時間、 劑量不同， 細胞周期呈動態(tài)改變， 但細胞幾乎不出現(xiàn)凋亡， 只在γ射線與LPS共同作用條件下細胞才出現(xiàn)凋亡， 一定程度說明細胞具有輻射抗性; 部分細胞呈現(xiàn)非整倍性， 而且這部分細胞DNA含量為正常未處理細胞的兩倍， 非整倍性的出現(xiàn)可能與細胞分裂受到抑制、 細胞功能的改變或細胞分化狀態(tài)相關。

ROI和DNA損傷是輻射信號轉(zhuǎn)導中的主要信使分子。我們觀察到0～40 Gy射線照射后6 h， RAW264.7細胞胞內(nèi)ROI水平隨照射劑量增加呈現(xiàn)增強趨勢， LPS能引起胞內(nèi)ROI水平升高， 而且 射線的預處理大大增強了LPS引起細胞ROI水平升高的效應。已有的研究表明， 0～10 Gy γ射線照射后24 h， RAW264.7細胞的DNA損傷隨受照劑量增加而增強［6］。在 射線促進IFNγ引起J774.1細胞中NO生成的過程中， 第二信使是DNA損傷而非ROI［1］。

S100A8能夠為輻射誘導表達， 紫外線誘導小鼠表皮角化細胞中S100A8的表達， ROI參與了此過程［7］。此外， 大鼠肝部受20 Gy射線照射后6 h S100A8蛋白水平升高， 而且該分子的誘導表達可能與受輻射后肝部ROI水平升高有關［8］。我們的研究發(fā)現(xiàn)， 單純γ射線或單純LPS處理條件下， RAW264.7細胞中S100A8 mRNA水平升高， 而且γ 射線與LPS具有協(xié)同作用。我們還檢測了通常與S100A8形成復合物行使生物學功能的S100A9分子mRNA的表達， 未能檢測到各種處理條件下該分子的表達及變化， 這與已有報道的研究結(jié)果一致［3， 4， 7， 8］， 說明S100A8本身具有功能特異性。我們的預實驗表明， ROI及轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1(activator protein1， AP1)可能參與了輻射誘導RAW264.7細胞中S100A8表達的過程。S100A8與炎癥反應密切相關， 那么S100A8誘導表達可能與RAW264.7細胞活性增強有關。此外， S100A8/A9復合物及S100A8、 S100A9具有抑制細胞增殖、 誘導細胞凋亡的功能［9］， γ 射線與LPS能夠增強RAW264.7細胞中S100A8表達、 引起該細胞凋亡， 兩者之間是否存在某種關聯(lián)還需要進一步的實驗驗證。

參考文獻

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篇4

[中圖分類號]R 783.1[文獻標志碼]A[doi]10.3969/j.issn.1673-5749.2012.01.009

Biological effects of nano-hydroxyapatite-aliphatic polyester-amide composite on the osteoblastsDeng Xia1, Xia Xi2.（1. Dept. of Stomatology, Nuclear of Industry 416 Hospital, Chengdu 610051, China; 2. Dept. of Prosthodontics, The Affiliated Hospital of Stomatology, Chongqing Medical University, Chongqing 400015, China）

[Abstract]ObjectiveTo evaluate the biological effects of nano-hydroxyapatite-aliphatic polyester-amide composite（nHA-PEA）on the osteoblast.MethodsThe Dulbecco minimum essential medium（DMEM）leaching liquor of nHA-PEA was applied to the osteoblasts of the test groups while the DMEM itself was applied to control. The methyl thiazolyl tetrazolium assay, flow cytometry and alkaline phosphatase（AKP）analysis were used to evaluate the changes in cell growth, cell cycle and cell function. Moreover, osteoblasts were cultured on the surface of nHA-PEA composite and the attachment, growth and proliferation of osteoblast were investigated. Results The cultured osteoblasts grew well and showed nomorphological variation. Osteoblasts of different test groups demonstrated relative proliferation rate ranging from 92%～107% without dose-dependent effect（P>0.05）. The cell cycle and AKP activity were similar in test and control groups（P>0.05）. Good cell attachment and proliferation manner were observed on the membranes. ConclusionnHA-PEA has no negative effects on the osteoblast and its osteoblastcompatibility is proved.

[Key words]nano-hydroxyapatite-aliphatic polyester-amide composite；osteoblast；biocompatibility

有機-無機復合生物材料是組織工程學研究的熱點[1]，該材料主要用于修復和重建人體的硬組織。納米羥磷灰石-脂肪族聚酯酰胺（nano-hydroxyapatite-aliphatic polyester -amide composite，nHA-PEA）復合材料由nHA粒子與PEA均勻混合制得，其中羥磷灰石（hydroxyapatite，HA）是人體骨、牙等無機組織的主要成分，PEA及其共聚物是一類新型的生物可降解高分子材料[2]。nHA- PEA復合材料兼具了有機物的韌性和無機物的剛性，具有良好的理化性能。本研究將nHA-PEA復合材料作用于體外培養(yǎng)的成骨細胞，檢測其對細胞生長、增殖能力、細胞周期、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）活性的影響，觀察細胞在其表面的黏附、鋪展形態(tài)，評價其對骨細胞的相容性和生物活性。

1材料和方法

1.1主要材料和儀器

達爾貝科極限必需培養(yǎng)液（Dulbecco minimum

essential medium，DMEM）、胰蛋白酶（Gibco公司，美國），新生小牛血清（成都哈里生物工程有限公司），甲噻唑四唑氮（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試劑（Sigma公司，美國），AKP試劑盒（北京柏定生物工程有限公司）。Sanyomco-17AI二氧化碳孵箱（Sanyo公司，日本），Olympus IX50相差倒置顯微鏡（Olympus公司，日本），JSM-5900LV型掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM；JEOL公司，日本），可見光高效分析儀/HTS 7000plus多孔板紫外/熒光（PE公司，美國），流式細胞計數(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM；Coulter公司，美國），LightCycler檢測儀（Roche公司，德國）。1.2浸提液制備

按文獻[3]制得4組nHA-PEA復合材料，按其無機和有機成分的質(zhì)量分數(shù)分組，分別為A組0和100%，B組10%和90%，C組20%和80%，D組30%和70%。將4組nHA-PEA復合材料（平均厚度0.5～1 mm）消毒滅菌后，按照國際標準化組織ISO 10993-5醫(yī)療器械生物學評價標準所推薦的試樣表面積和浸提介質(zhì)為6 cm2·mL－1的比例[4]，置37℃濾除細菌的培養(yǎng)液中，浸提3～4 d的浸提液備用。

1.3成骨細胞培養(yǎng)和細胞懸液的制備

取生長穩(wěn)定的第4代SD乳鼠顱骨成骨細胞，經(jīng)質(zhì)量分數(shù)0.25%的胰酶消化后行細胞計數(shù)，用DMEM配制5×104個每毫升的細胞懸液。

1.4甲噻唑四唑氮比色

將200μL密度為5×104個每毫升的細胞懸液加入96孔板，置于體積分數(shù)5%的二氧化碳培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)24 h，細胞貼壁后棄掉原有培養(yǎng)液，將細胞分為試驗組（A～D）和對照組（E），試驗組每組均分別加入200、100、50μL終質(zhì)量分數(shù)分別為100%、50%和25%的浸提液，形成A1、

A2、A3，B1、B2、B3，C1、C2、C3，D1、D2、D3，

對照組加入原培養(yǎng)液。每日于相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，生長和增殖情況。分別于第1、3、5、7 d各取96孔板1塊，每孔加入20μL的MTT，孵育4 h，每孔加入200μL二甲基亞砜，振蕩1 min，混勻，570 nm波長下測定各孔吸光度（A），取3孔均值，計算細胞增殖率（proliferation rate，RP）：RP=（A試驗組/A對照組）×100%。1.5流式細胞計數(shù)

接種對數(shù)生長期的成骨細胞1×105個每毫升瓶，細胞貼壁后A～D組棄原培養(yǎng)液加入質(zhì)量分數(shù)均為100%的復合材料浸提液，E組加入新鮮原培養(yǎng)液，標準環(huán)境下3 d換液1次，培養(yǎng)7 d，消化、離心并收集沉淀細胞。流式細胞計數(shù)DNA熒光強度及散光參數(shù)，Multicycle軟件分析細胞的周期分布和程序性死亡情況。1.6堿性磷酸酶活性檢測

取1×105個每毫升的細胞懸液3 mL加入小號培養(yǎng)瓶，將其置于體積分數(shù)5%的二氧化碳培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)24 h，細胞貼壁后棄掉原有培養(yǎng)液，A～D組均加入質(zhì)量分數(shù)100%的浸提液，E組加入新鮮原培養(yǎng)液，分別于第4天和第7天中止培養(yǎng)，收集80μL細胞懸液，以AKP試劑盒通過HTS 7000plus多孔板高效分析儀行AKP活性測試。

1.7成骨細胞與材料的復合培養(yǎng)

將載有nHA-PEA復合膜的血蓋片試樣置于6孔板內(nèi)，環(huán)氧乙烷冷消毒，磷酸緩沖鹽溶液浸泡清洗3次，每次1 h，DMEM孵育過夜備用。取1×105個每毫升的細胞懸液，分別接種于已準備好的材料上，37℃，體積分數(shù)5%的二氧化碳孵箱繼續(xù)靜置培養(yǎng)5 d。分別于第1天和第5天將試樣取出，以體積分數(shù)10%的多聚甲醛固定，體積分數(shù)30%～100%的乙醇梯度脫水，醋酸異戊酯置換乙醇，臨界點干燥，表面噴金，SEM下觀察。1.8統(tǒng)計學分析

使用單因素方差分析，分析各組總體均數(shù)間差別有無統(tǒng)計學意義，在檢驗數(shù)據(jù)之前對數(shù)據(jù)行方差齊性檢驗。用q檢驗比較兩組間均數(shù)的差別。P>0.05為差異無統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1細胞生長觀察及甲噻唑四唑氮比色結(jié)果

顯微鏡下，不同質(zhì)量分數(shù)的nHA-PEA復合材料浸提液組及對照組細胞培養(yǎng)6 h后均已貼壁，12 h細胞突逐漸舒展，24 h細胞開始鋪展，72 h后細胞數(shù)目明顯增多，排列規(guī)則密集，細胞呈梭形、三角形或不規(guī)則形，形態(tài)分析各試驗組與對照組細胞形態(tài)相似，顯示各組細胞均生長良好。試驗組和對照組不同時間的MTT比色結(jié)果見表1。試驗組間的MTT值及其與其對照組間的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；試驗組成骨細胞的相對增殖率為92%～107%，不同質(zhì)量分數(shù)的nHA-PEA復合材料浸提液組對成骨細胞的細胞毒性級數(shù)為0～

1級（0級：細胞相對增殖率大于等于100%，1級：細胞相對增殖率為90%～99%）[5]，不同質(zhì)量分數(shù)浸提液組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

3討論

在生物醫(yī)學材料的細胞毒性試驗方法中，最常用的是材料浸提液培養(yǎng)法和細胞材料直接接觸法。本試驗綜合運用了這兩種方法，首先選擇浸漬法，具體原因如下。1）對于nHA-PEA復合材料，nHA的生物相容性勿庸置疑；而PEA是新型的人工合成的生物降解型高分子材料，其理化性能和降解性能已有相關研究[6]，但其生物相容性鮮有報道。2）由于直接接觸法共同培養(yǎng)時，細胞對材料表面和對培養(yǎng)孔板底部的黏附性有差異，細胞洗脫率的不同會產(chǎn)生干擾而使試驗復雜化。事實上，僅需考察nHA-PEA復合材料溶出物的

細胞毒性，就可以達到初步評價其生物相容性的目的，而且以材料的浸提液代替材料本身在材料學的研究中已得到公認。本試驗嚴格按照國際標準化組織ISO 10993-5醫(yī)療器械生物學評價標準和要求制備生物醫(yī)學材料浸提液[4]，以浸提出最大量的濾出物質(zhì)，考察其對成骨細胞增殖和細胞周期的影響。

MTT比色是常用的細胞增殖能力檢測方法，可以對材料的細胞毒性作出可靠的定量評價[5]。本試驗在相差倒置顯微鏡下觀察到nHA-PEA復合材料浸提液不影響細胞的生長形態(tài)；MTT值在試驗組間以及各組與對照組間差異無統(tǒng)計學意義，試驗組的細胞增殖率在92%～107%，表明nHA-PEA復合材料浸提液對成骨細胞的生長無不良影響。因此在進一步地對細胞周期和功能進行的分析中，僅選用最高質(zhì)量分數(shù)的nHA-PEA復合材料浸提液作為試驗組進行分析比較。在加入HA的試驗組，MTT值略高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義且無量效關系。原因可能與其中的鈣、磷水平較高有關。

流式細胞計數(shù)已廣泛應用于腫瘤學、生物化學和免疫學等領域，細胞周期檢測已成為生物材料生物相容性評價的一種可靠方法和指標[7]，是常規(guī)細胞增殖試驗的一項重要補充。近年來，生物材料生物相容性研究進展之一是生物材料的生物功能性評價[8]。生物材料作用于細胞后使其周期改變，從而使其行為和功能發(fā)生改變。本試驗在MTT比色的基礎上進一步使用流式細胞計數(shù)，旨在從細胞增殖周期的角度來分析nHA-PEA復合材料浸提液對細胞增殖周期DNA合成的影響，從分子水平上評價材料的細胞毒性。從MTT比色可見，組間、組內(nèi)不同質(zhì)量分數(shù)的nHA-PEA復合材料浸提液對成骨細胞的增殖和增殖周期影響不大，細胞周期各亞期組成比和程序性死亡率差異亦無統(tǒng)計學意義。B、C、D組處于S期的細胞略多，表明加入HA對細胞增殖有一定促進作用，但不顯著，不存在量效關系。此結(jié)果與MTT比色結(jié)果一致。

除了對細胞增殖的影響，生物材料的細胞相容性還表現(xiàn)在材料對細胞重要功能的影響。AKP是骨形成所必需的酶，是生物礦化和成骨細胞分化成熟的早期標志物[9-10]：其表達代表骨形成狀況，表明細胞分化的開始，并隨細胞分化的發(fā)展而增強；其活性的高低，反映了相應細胞向成骨方向化的趨勢。本研究采用酶聯(lián)法對成骨細胞AKP的表達進行檢測，結(jié)果顯示試驗組AKP的表達量與對照組相比較差異無統(tǒng)計學意義，說明nHA-PEA復合材料對成骨細胞的功能酶表達無不良影響，也沒有明顯的促進作用，不抑制其分化功能。

用浸提液作為試驗樣品測定復合材料中濾出物質(zhì)對細胞生長、增殖的影響，僅為預測材料植入體內(nèi)的潛在危害提供了初步依據(jù)，其結(jié)果尚有一定的局限性；因此，需在浸漬試驗良性結(jié)果的基礎上再采用直接法將成骨細胞與材料聯(lián)合培養(yǎng)，以進一步考察材料本體的結(jié)構(gòu)性能對細胞生物學的影響。本研究表明，成骨細胞在復合材料上具有良好的黏附、鋪展和增殖行為，即nHA-PEA復合材料具有成骨細胞相容性和良好的細胞相容性等特性。

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篇5

目的： 研究不同粒徑磁性納米FeOx在外加磁場作用下對肝癌細胞增殖、凋亡的影響。方法： 采用共沉淀法制備得到不同粒徑FeOx，將不同粒徑FeOx吸附于細胞表面，并加載靜磁場(SMF)及100 Hz交變磁場(EMF)照射。運用CCK8檢測納米粒子吸附后在外加磁場作用下Bel7402細胞增殖情況，運用流式細胞儀檢測細胞凋亡、死亡率及細胞周期變化。結(jié)果： 不同粒徑磁性納米FeOx在SMF照射時間低于72 h時能使Bel7402細胞增殖速度增快，當照射時間大于72 h時，細胞增殖速度未發(fā)生明顯變化但部分細胞發(fā)生凋亡，凋亡率為(3.1±0.78)％。而經(jīng)EMF照射后37 nm FeOx吸附細胞增殖被抑制，細胞周期實驗結(jié)果表明大部分細胞被阻滯在G0/G1期，細胞出現(xiàn)大量死亡與凋亡，凋亡率達到(23.34±3.6)％、死亡率達到(57.24±2.7)％。結(jié)論： 納米粒子未有外加磁場照射時不能對細胞產(chǎn)生明顯的影響，外加SMF照射時，細胞的增殖及DNA代謝未發(fā)生明顯的變化，但細胞發(fā)生凋亡；外加EMF照射時，細胞增殖被抑制并發(fā)生明顯的凋亡及死亡，細胞DNA代謝明顯紊亂，且具有較小粒徑的磁性納米FeOx在EMF作用下對肝癌細胞影響最為顯著。

【關鍵詞】 磁性納米FeOx； 增殖； 凋亡； DNA周期

［Abstract］Objective: To study the effects of different diameters of nano FeOx powders on proliferation and DNA metabolism of heptomacell lines Bel7402.Methods： Different diameters of nano FeOx powders were utilized to dope the heptomacell lines Bel7402 through the coprecipitation meanings， then cells were exposed by static magnetic field(SMF) and extremely low frequency altering magnetic field(EMF) with 100 Hz. After exposed by external fields， CCK8 kit was used to detect the effects on proliferation of cells caused by nano powders. Apoptosis kit and DNA cycle kit was used to detect the effects caused by nano FeOx of cell apoptosis， death and cell DNA cycle metabolism. Results： Different diameters nano FeOx could not influence the cell at all under SMF exposure but could influence the cells under EMF， when the diameter was 37 nm the highest apoptosis and death ration were (23.34±3.6)％ and (57.24±2.7)%， respectively， and the most of cells were prohibited in G0/G1 period of DNA cycle. Conclusion： nano powders could not influence the cells at all without external magnetic field exposure. Under SMF exposure the proliferation and DNA metabolism of cells absorbing by nano powders were not influenced， but the apoptosis ratio of cells was increased. After exposure by EMF cells absorbing by nano powders could be affected in proliferation， apoptosis and DNA metabolism，furthermore， all the effects were more obvious in the cells absorbing by nano powders with little diameter under EMF exposure.

［Key words］magnetic nano FeOx； proliferation； apoptosis； DNA cycle

磁性納米材料具有良好的磁導向性、較好的生物相容性、生物降解性和活性能基團等特點［1-3］，它可結(jié)合各種功能分子，如酶、抗體、細胞、DNA或RNA等，因而在靶向藥物、控制釋放、酶的固定化、免疫測定、DNA和細胞的分離與分類等領域可望有廣泛的應用。磁性納米材料特別是Fe屬納米顆粒已經(jīng)被廣泛應用于藥物靶向治療及干細胞定向移植治療中［4］。當粒徑在30～200 nm之間時，矯頑力和飽和磁化強度均達到最大值，且具有單疇特性。目前已有納米磁性氧化鐵等顆粒作為藥物或干細胞載體用于肝癌動物實驗的研究，但對磁性納米氧化鐵粒子本體對人體研究相對較少［5］。本研究以肝癌細胞Bel7402為對象，觀察不同粒徑磁性納米FeOx在外加磁場作用下對其生物學特性的影響，旨在為FeOx用于治療肝癌提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑及儀器

肝癌細胞株Bel7402購自中國科學院上海細胞庫。靜磁場發(fā)生儀為兩塊強磁場稀有金屬鎳/鐵永磁體，當兩塊磁體間距為2.5 cm時其場強為0.7特斯拉（T）。TYU2002H II型特斯拉計/高斯計為上海亨通磁電科技有限公司產(chǎn)品。變頻儀(FT1000型)為南京萬臣電子有限公司產(chǎn)品，變壓器(PT800型)為上海富濟電子公司產(chǎn)品。胰蛋白酶、Primilar1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自Gibco公司，二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司，維生素C、青霉素、鏈霉素為杭州四季青公司產(chǎn)品。CCK8試劑盒為美國ADL公司產(chǎn)品，細胞凋亡及周期試劑盒均購自美國BD公司。FeSO4、醋酸鋅均為分析純，購自南京化學試劑有限公司。掃描電鏡(SEM)型號為HITACHIX650，X射線衍射儀(XRD)型號為Philips X′pert XRD system型。

1.2 方法

1.2.1 磁性納米FeOx的制備

運用共沉淀法［5］以FeSO4及醋酸鋅為反應物，反應在乙醇、水（1∶3）混合溶劑中進行并加入質(zhì)量百分比為2％的甘油，制備得到醋酸亞鐵前驅(qū)體，前驅(qū)體粉末灼燒溫度為400℃，灼燒4 h后得到FeOx粉體，10 000 r/min離心30 min，得到上下兩層不同粒徑粉末，經(jīng)SEM及XRD實驗確定其粒徑及成分組成。SEM實驗前樣品用超聲清洗儀超聲分散10 min。XRD實驗條件為：掃描速率為2θ/min，測定納米粉體XRD譜。

1.2.2 磁性納米FeOx吸附細胞實驗

將不同粒徑納米FeOx加入到細胞培養(yǎng)瓶中與細胞共同培養(yǎng)。納米粒子吸附細胞方法為：將細胞消化成細胞懸液并調(diào)整細胞濃度大于105個/ml，再將不同粒徑納米粒子加入到細胞懸液中并在恒溫搖床中勻速振蕩30 min，搖床搖速為200 r/min。振蕩完成后將細胞置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)2 d后經(jīng)SEM實驗確定磁性納米FeOx結(jié)合效率。

1.2.3 細胞培養(yǎng)

細胞種植到含10％FBS PIMIRIER 1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶，放置在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱持續(xù)培養(yǎng)。細胞傳代時用胰蛋白酶消化細胞成細胞懸液，磷酸鹽緩沖液（PBS）1 500 r/min 15 min離心洗滌2次，用含10％FBS 1640培養(yǎng)基重懸細胞后種植細胞，每次細胞種植濃度應大于105個/ml。細胞臨時保存在-70℃超低溫冰箱，永久保存在液氮罐中，細胞凍存液配比為DMEM∶FBS∶DMSO=7∶2∶1(體積比)，細胞凍存濃度應高于106個/ml。

1.2.4 磁場照射細胞方法

靜磁場(SMF)照射細胞方法為：將細胞培養(yǎng)瓶置于兩塊永磁體之中，同時置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每間隔12 h照射1次，每次照射30 min，直至84 h。100 Hz交變磁場(EMF)照射細胞方法為：將細胞培養(yǎng)瓶置于離工作線圈頂端2 cm，經(jīng)特斯拉計測量磁感應強度為0.67 mT，每間隔4 h照射1次，每次照射30 min，直至40 h。照射完成后，細胞用胰蛋白酶消化成細胞懸液進行各種檢測。

1.2.5 CCK8細胞增殖實驗

按試劑盒提供實驗方法進行。首先取出96孔酶標板，依照次序?qū)謩e加入50 μl的標準品于酶標板微孔中，分別標記樣品編號，將50 μl細胞培養(yǎng)懸液（2.5×104個/ml）加入到酶標板中；在標準孔和樣品孔中加入100 μl的酶標記液，36℃孵育1 h，將溶液傾出， PBS清洗5次后每孔加入底物A，B液各50 μl，36℃下避光孵育反應15 min后加入終止液50 μl，終止反應。測定450 nm的光密度值。每隔12 h重復進行以上步驟，72 h得到細胞增殖數(shù)據(jù)繪制細胞增殖曲線。

1.2.6 細胞凋亡、死亡及周期實驗

細胞凋亡及周期實驗均在流式細胞儀上完成，均按試劑盒提供實驗方法進行。凋亡實驗方法為：將細胞用胰蛋白酶消化成細胞懸液，并用PBS洗滌2次并將細胞濃度重懸調(diào)整為106個/ml。染色過程為首先用微量移液槍移取20 μl細胞懸液，然后用AnnexinV加入到細胞懸液中并避光靜置15 min后將PI染料加入并靜置30 min，染色完成后上機實驗。細胞周期實驗方法為：首先按凋亡實驗相同方法處理細胞以待上機檢測，染色方法為將試劑盒內(nèi)A，B，C，D 4種試劑按順序分別加入到細胞懸液中，避光靜置時間均為15 min。染色完成后上機實驗。流式細胞儀實驗條件為：細胞進樣流速中速，前向角補償電勢為56 V。

1.2.7 統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果用±s表示，使用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析，以α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 納米FeOx表征實驗結(jié)果

SEM及XRD實驗結(jié)果表明兩種粒子的平均粒徑分別為37，70 nm左右，粒子形狀為不規(guī)則球形（圖1，2）。根據(jù)Scherrer 公式：D=Kλ/βcosθ，其中D為粒子粒徑，K為形狀因子，λ為X 衍射的波長，β為衍射峰的半峰寬，θ為衍射角。經(jīng)XRD實驗結(jié)果證明粒子中Fe，O兩種元素的比例為1∶1.12。圖3為2種FeOx與Bel7402細胞吸附情況，圖中FeOx為黑色顆粒，F(xiàn)eOx與Bel7402細胞發(fā)生了較為明顯的吸附，37 nm粒子更易于在細胞表面吸附，表現(xiàn)為每個細胞表面吸附粒子數(shù)量明顯增加。

(a)37 nmFeOx(×30 000倍）(b)70 nmFeOx(×10 000倍)

2.2 細胞增殖實驗結(jié)果

不同粒徑納米FeOx在未經(jīng)磁場照射時并未對細胞增殖產(chǎn)生明顯的影響，細胞經(jīng)SMF照射其增殖在磁場照射初期速度變快，當照射時間超過72 h后增殖未發(fā)生明顯改變(相對對照組)。 經(jīng)EMF照射后兩種粒子吸附細胞的增殖均被抑制，當EMF照射時間為5 h時細胞增殖抑制率達到最大，37nm FeOx抑制率達到（76.31±2.3）％，70 nm FeOx抑制率為（53.56±5.2）％。

2.3 細胞凋亡及死亡實驗結(jié)果

從表1可見，凋亡率、死亡率3組間比較差異無統(tǒng)計學意義，說明未經(jīng)磁場照射的納米粒子不能導致細胞死亡及凋亡。表2可見37 nm和70 nm FeOx吸附細胞經(jīng)SMF照射達到60 h后，細胞發(fā)生凋亡，當照射時間為72 h時37 nm FeOx吸附細胞的凋亡率為（3.13±0.78）％，70 nm FeOx吸附細胞的凋亡率僅為（1.25±0.23）％。而未經(jīng)磁場照射37nm FeOx吸附細胞的凋亡率為（0.01±0.03）％，70 nm FeOx吸附細胞的凋亡率為（0.02±0.04）％，未經(jīng)FeOx吸附細胞的凋亡率為（0.01±0.02）％。表1 37 nm和70 nm FeOx吸附細胞自然生長凋亡率及死亡率，Tab 1 Apoptosis and death ration of Bel7402 absorbed by different diameters nano FeOx（略）；表2 37 nm和70 nm FeOx吸附細胞經(jīng)SMF照射細胞凋亡率及死亡率，Tab 2 Apoptosis and death ration of Bel7402 absorbed by different diameters nano FeOx exposed by SMF（略）。

表3表明隨著EMF照射時間的延長，細胞凋亡率隨之增加，當照射時間達到5 h時其凋亡率最大，37 nm FeOx吸附細胞的凋亡率為（23.34±3.6）％，死亡率（57.24±2.7）％。而70 nm FeOx吸附細胞的凋亡率為（12.54±6.7）％，死亡率為（37.28±4.2）％。當照射時間超過5 h后，細胞凋亡率增速變慢。表3 37 nm和70 nm FeOx吸附細胞經(jīng)EMF照射凋亡率及死亡率，Tab 3 Apoptosis and death ration of Bel7402 absorbed by different diameters nano FeOx exposed by EMF（略）

2.4 細胞周期實驗結(jié)果

從表4可見，37 nm和70 nm FeOx吸附細胞自然生長細胞周期，與未經(jīng)處理Bel7402細胞作比較，無統(tǒng)計學意義，與凋亡實驗結(jié)果相符，表明FeOx吸附細胞并不能影響細胞周期代謝。表5表明當細胞被納米粒子吸附并在外加SMF照射下細胞DNA代謝未發(fā)生紊亂，在SMF照射初期細胞處于S，G1期細胞比例增加，細胞增殖變快，與細胞增殖實驗結(jié)果吻合，當照射時間超過72 h后細胞處于G0期含量增加，細胞進入增殖靜止期。凋亡實驗結(jié)果表明此時細胞發(fā)生明顯的凋亡，表明細胞凋亡通路被激活，細胞增殖可能被抑制。表4 37 nm和70 nm FeOx吸附細胞自然增殖細胞周期實驗結(jié)果，Tab 4 Proliferation results of Bel7402 absorbed by different diameters nano FeOx（略）；表5 37 nm和70 nm FeOx吸附細胞經(jīng)SMF照射細胞周期實驗結(jié)果，Tab 5 Proliferation results of Bel7402 absorbed by different diameters nano FeOx exposed by SMF（略）。

表6表明，37 nm和70 nm FeOx吸附細胞在外加EMF作用下，細胞DNA代謝均發(fā)生明顯變化，細胞周期中G0/G1值增加， 照射5 h時37 nm粒子吸附細胞值為（91.6±1.3）％，而70 nm粒子吸附細胞值為（63.5±2.4）％，細胞增殖被抑制。表6 37 nm和70 nm FeOx吸附細胞經(jīng)EMF照射細胞周期實驗結(jié)果，Tab 6 Proliferation results of Bel7402 absorbed by different diameters nano FeOx exposed by EMF（略）。

3 討論

磁性納米材料已經(jīng)被用作藥物或干細胞的載體用于各種疾病的靶向治療［6］，但現(xiàn)有研究多集中于納米粒子與藥物或干細胞的吸附研究，對磁性納米粒子本體在外加磁場作用下對細胞或生物體影響的研究較少，本研究即以磁性納米FeOx在外加磁場作用下對肝癌細胞Bel7402的影響為研究對象。

我們采用共沉淀法制備得到的納米FeOx粒子的平均粒徑分別為37 nm及70 nm且粒徑分布均勻。粒子形狀為不規(guī)則球形，XRD實驗結(jié)果表明粒子的表面有較多的空間位隙，導致粒子中兩種元素的化學計量比不規(guī)則，其Fe與O計量比為1∶1.12。已有研究表明具有晶格缺陷的納米粒子更容易吸附小分子物質(zhì)或更容易吸附在其他物質(zhì)表面［7］，本文合成得到的納米粒子具有較多的晶格缺陷，實驗用納米FeOx較易在細胞表面發(fā)生吸附。

細胞增殖實驗表明，37 nm和70 nm FeOx吸附在細胞表面后在SMF照射條件下，細胞增殖速度在照射初始階段增加，當照射時間超過72 h后細胞發(fā)生凋亡，但增殖速度未發(fā)現(xiàn)明顯變化，可能由于FeOx吸附細胞后在SMF照射條件下更易沉降到細胞培養(yǎng)瓶底部。納米FeOx并不能影響細胞的正常分裂與增殖，同時SMF照射細胞也不能引起細胞發(fā)生改變，與文獻報道結(jié)果類似［8］。EMF照射細胞能抑制細胞增殖，細胞增殖時間明顯延長，當EMF照射時間達到5 h后，EMF照射FeOx吸附細胞抑制達到最大。比較兩種FeOx吸附細胞在EMF照射條件下細胞增殖結(jié)果可以得出，37 nm FeOx粒子對細胞的增殖抑制更為顯著，表明納米FeOx在EMF照射下能很好地抑制肝癌細胞的增殖。

EMF照射細胞本身能影響細胞的增殖，導致細胞早期凋亡以及細胞DNA代謝發(fā)生紊亂和DNA雙鏈斷裂［9］。本研究表明，納米粒子吸附到細胞表面后在外加EMF作用條件下這種影響更為明顯，具有更小粒徑的FeOx在EMF作用下對細胞凋亡的影響更為顯著。同時，隨著EMF照射時間增加，F(xiàn)eOx吸附的細胞DNA代謝發(fā)生紊亂，大部分細胞被阻滯在G0/G1期，同時處于S期的細胞含量減少，表現(xiàn)為明顯的S期和G2 期阻滯。

納米粒子在吸附到細胞表面后可一定限度地改變細胞表面電勢，EMF同樣能改變細胞表面的電勢而導致細胞發(fā)生凋亡等生理現(xiàn)象［9，10］。兩種外加因素對細胞的影響有明顯的疊加效果，納米FeOx在外加EMF作用下發(fā)生明顯的振蕩現(xiàn)象能較大程度改變細胞膜表面的電勢分布，從而改變Na+，K+，Ca2+等離子通過細胞膜表面的速度和方向，Ca2+代謝與細胞的凋亡相關，Na+，K+與細胞死亡和DNA代謝相關［10］。同時，納米FeOx在磁場作用下發(fā)生振蕩能導致明顯的熱效應［11］，導致細胞發(fā)生凋亡或死亡以及導致細胞DNA發(fā)生明顯的代謝紊亂。37 nm FeOx在外加EMF作用下對Bel7402的影響更為明顯，在EMF作用下振蕩更為劇烈［12］。

綜上所述，不同粒徑磁性納米FeOx吸附在細胞表面并不能影響細胞的增殖，也不能導致細胞發(fā)生凋亡或DNA代謝紊亂；在SMF照射時，在磁場照射初期能提高吸附有納米粒子的細胞增殖速率，當照射時間達到72 h時能導致細胞發(fā)生凋亡；在EMF照射時，吸附有納米FeOx細胞的凋亡及死亡率急劇變大，表明磁性納米粒子與EMF對細胞的作用有疊加效果，具有較小粒徑的納米FeOx在EMF作用下對細胞的影響更為劇烈。磁性納米FeOx在外加EMF作用下能很好地抑制細胞的增殖。對納米粒子在細胞表面的吸附率、與細胞的融合以及對細胞膜表面電勢的影響及熱效應還需進行更為深入的研究。

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篇6

【Abstract】 AIM: To observe the effects of the demethylating agent， 5Aza2′deoxyctidine (5AzaCdR)， on the proliferation， cell cycle， apoptosis and xaf1 mRNA expression of stomach cancer BGC823 cells. METHODS: The proliferation of BGC823 cells treated by different concentrations of 5AzaCdR was detected by MTT assay. Assessment of cell cycle and apoptosis were performed by flow cytometry (FCM); the change of xaf1 mRNA expression was semiquantified by RTPCR before and after 5AzaCdR treatment. RESULTS: The growth inhibitory effects on BGC823 cells were observed in a dosedependent manner after exposure to 5AzaCdR at different concentrations (1×103， 5×103， 10×103 nmol/L) for different time. FCM analysis showed that the apoptosis rates in BGC823 cells ［(4.53±0.21)%， (8.11±1.01)%， (11.56±0.86)%］ increased significantly after exposure to 5AzaCdR for 72 h as compared with the control group ［(0.51±0.01)%， P

【Keywords】 5AzaCdR；xaf1；BGC823；methylation；proliferation；apoptosis

0 引言

凋亡抑制蛋白因子家族(IAP)的成員在結(jié)構(gòu)上具有1至3個高度保守的桿狀病毒凋亡抑制因子重復序列(BIR)結(jié)構(gòu)域［1］，在腫瘤的增殖異常及對抗腫瘤藥物耐受形成中發(fā)揮了重要作用. X染色體相關凋亡抑制蛋白(XIAP)是IAP中抑制Caspase活性最強的成員. XIAP相關因子1(XAF1)是一個新近發(fā)現(xiàn)可以拮抗XIAP抗凋亡作用的蛋白，它可以逆轉(zhuǎn)XIAP對細胞的保護. XAF1在多種腫瘤細胞和組織中存在低表達或表達缺失，XAF1的基因沉默與其啟動子高甲基化明顯相關［2］. 我們采用5AzaCdR對胃癌細胞株進行處理， 檢測xaf1基因表達，并分析腫瘤細胞生物學行為變化，以期進一步探討胃癌的發(fā)生機制及治療的新方法.

1 材料和方法

1.1 材料 胃癌BGC823細胞株（蘭州大學病理解剖學教研室）；RPMI1640培養(yǎng)液（美國Gibco公司）；胎牛血清（蘭州民海生物技術有限公司）；5AzaCdR（美國Sigma公司）；配制5AzaCdR為1 mol/L的母液，-20℃保存，使用時用RPMI1640稀釋為工作濃度. Tap酶（上海生工生物工程技術有限公司）；酶聯(lián)免疫檢測儀(BioTek公司)；Trizol(Invitrogen公司)；UV3000紫外分光光度儀（上海美譜達公司）；流式細胞儀(Beckman Coulter公司).

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 細胞貼壁生長于RPMI1640培養(yǎng)液中，內(nèi)含100 mL/L胎牛血清、1×105/L青霉素、100 mg／L鏈霉素和2 mmol/L L谷氨酰胺，置于37℃ 50 mL/L CO2的飽和濕度箱中培養(yǎng)，每3～4 d消化傳代1次. 傳代時，常規(guī)消化BGC823細胞，置于75 mm培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h后分別用含1×103，5×103，10×103 nmol/L 5AzaCdR的完全培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)24，48和72 h后棄去藥液，用完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進行實驗. 以同體積磷酸鹽緩沖液PBS(pH 7.4)處理的細胞作為對照組. 培養(yǎng)過程中使用相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化.

1.2.2 MTT法繪制細胞生長曲線 取對數(shù)生長期細胞，常規(guī)消化后按每孔2×103個(100 μL)接種于6塊96孔培養(yǎng)板中，過夜貼壁后棄完全培養(yǎng)液，分別加入含1×103，5×103，10×103 nmol/L 5AzaCdR藥液的完全培養(yǎng)液，每孔100 μL，每組設3個復孔；對照組加入等量PBS. 每日取出1板加入5 g/L MTT液10 μL，37℃孵育4 h后加DMSO 150 μL，振蕩器振蕩10 min充分溶解結(jié)晶，在酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔A470 nm值，求其平均值，以A470 nm值為縱坐標，時間(d)為橫坐標繪制生長曲線，計算細胞增殖抑制率(cellular proliferation inhibition rate，CPIR). CPIR(％)=(1-實驗組A470 nm均值／對照組A470 nm均值)×100％.

1.2.3 RTPCR檢測xaf1基因mRNA表達 取對數(shù)生長期BGC823細胞，藥物處理方法同1.2.1. 收集細胞，Trizol一步反向法抽提細胞總RNA，在紫外分光光度儀上測定吸光度值，鑒定RNA純度，A260 nm／A280 nm在1.8～2.0之間. PCR引物設計及反應條件如下：xaf1：預期產(chǎn)物片段大小為120 bp，退火溫度：56℃；Sense：5′TGGGTGTAGGATTCTCCAGG3′，Antisense：5′GGTTTGCCCAAGGACTACAA3′. 內(nèi)參照GAPDH:預期產(chǎn)物片段大小為456 bp，退火溫度：52℃；Sense：5′TTCTCCCCATTCCGTCTTCC3′，Antisense：5′GTACATGGTATTCACCACCC3′，上述引物由大連寶生物有限公司提供合成. 兩步法RTPCR：① 逆轉(zhuǎn)錄反應：20 μL反應體系含：2 μg模板RNA，0.5 g/L Oligo(dT)18，RNasefree ddH2O，5×Reaction Buffer，2×107 U/L RNase Inhibitor，10 mmol/L dNTP Mix，2×107 U/L AMuLV RT. 70℃ 5 min，37℃ 5 min，37℃ 60 min，70℃ 10 min，4℃保存. ② 聚合酶鏈反應：50 μL反應體系含：cDNA 1 μL，10×buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl2 3 μL，2.5 mmol/L dNTP 5μL，Tap酶0.5 μL，上下游引物各1 μL，去離子水補至50 μL，GAPDH作內(nèi)參照. PCR儀擴增條件：94℃變性4 min，按94℃ 30 s，52℃（或54℃）40 s，72℃ 45 s，進行35個循環(huán)，最后一個循環(huán)72℃延伸5 min. PCR產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像分析系統(tǒng)分析，以xaf1和GAPDH吸光度比值相對定量.

1.2.4 細胞周期和凋亡率檢測 取對數(shù)生長期BGC823細胞，藥物處理方法同1.2.1. 收集培養(yǎng)細胞，PBS洗2次，調(diào)整細胞密度為1×109個／L，700 mL/L冷乙醇－20℃固定24 h，加RNaseA至終濃度1 g/L，37℃溫育30 min，加碘化丙啶至終濃度50 g／L，1 h內(nèi)測定. 以流式細胞儀進行細胞周期分析和凋亡率的檢測.

統(tǒng)計學處理:實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS 11.5軟件進行分析，不同組間率的比較采用單因素方差分析.

2 結(jié)果

2.1 5AzaCdR對細胞增殖的影響 分別用1×103，5×103，10×103 nmol/L 5AzaCdR處理6 d后，BGC823細胞的生長增殖活性均有明顯抑制，3個試驗組的CPIR值分別為（22.36±0.68）%，（32.12±1.27）%和（41.34±1.62）%，與對照組相比差異顯著（P

bP

圖1 BGC823細胞經(jīng)5AzaCdR處理前后的生長曲線（略）

2.2 5AzaCdR對細胞中xaf1基因mRNA表達的影響 5AzaCdR處理前BGC823細胞系的xaf1基因mRNA不表達，在經(jīng)5×103，10×103 nmol/L 5AzaCdR處理后，xaf1基因mRNA重新表達，10×103 nmol/L的5AzaCdR處理組尤為明顯，在用藥48，72 h后，該基因表達呈明顯上升的趨勢(圖2，3).

2.3 5AzaCdR對細胞周期的影響 BGC823細胞經(jīng)1×103，5×103，10×103 nmol/L 5AzaCdR處理72 h后，S期的細胞數(shù)量逐漸增加，G2/M期細胞數(shù)下降，凋亡率明顯增加 (表1).

M：50 bp DNA Ladder maker D512A；1：對照組；2～4：5×103 nmol/L 5AzaCdR分別作用24，48和72 h；5～7：10×103 nmol/L 5AzaCdR分別作用24，48和72 h.

圖2 BGC823細胞經(jīng)5AzaCdR處理前后GAPDH mRNA的表達（略）

M：50 bp DNA Ladder maker D512A；1：對照組；2～4：5×103 nmol/L 5AzaCdR分別作用24，48和72 h(相對定量值分別為0.22，0.32，0.37)；5～7：10×103 nmol/L 5AzaCdR分別作用24，48和72 h(相對定量值分別為0.90，0.98，1.31).

圖3 BGC823細胞經(jīng)5AzaCdR處理前后xaf1 mRNA的表達（略）

表1 BGC823細胞經(jīng)5AzaCdR處理72 h后細胞周期的變化（略）

aP＜0.05， bP＜0.01 vs對照.

3 討論

DNA甲基化是由S腺苷甲硫氨酸(SAM)作為甲基供體，在細胞內(nèi)甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的催化作用下，在胞嘧啶(C)的第五位碳原子上加上甲基基團，變成5甲基胞嘧啶(5mC)的化學修飾過程［3］. 近期研究表明，多種人類腫瘤在發(fā)展過程中表現(xiàn)異常DNA甲基化模式，常見為甲基化酶水平提高、整個基因組范圍甲基化減弱以及局部甲基化水平增高3種，以局部甲基化水平增強較多見［4］. xaf1基因定位于染色體17p13.2位點，研究表明，xaf1基因在多種腫瘤細胞株以及肝癌［5］、結(jié)腸癌［6］、黑色素細胞瘤［7］組織中表達降低，存在轉(zhuǎn)錄抑制現(xiàn)象，現(xiàn)已證明xaf1基因表達沉默與5′區(qū)域CpG島異常高甲基化相關，轉(zhuǎn)錄過程中調(diào)控區(qū)域的CpG島高甲基化導致xaf1基因表遺傳修飾而失活. 我們采用不同濃度(5×103，10×103 nmol/L)的特異性DNMT抑制劑5AzaCdR，對體外培養(yǎng)的胃癌BGC823細胞進行干預，RTPCR結(jié)果顯示在5AzaCdR作用前，xaf1 mRNA不表達，而在5AzaCdR作用后，xaf1 mRNA又重新表達，表達強度呈時間和劑量依賴關系，表明DNA甲基化與基因遺傳學改變不同，基因的缺失、突變等遺傳學改變是不可逆的，而甲基化的DNA核苷酸序列未發(fā)生改變，僅通過個別堿基的修飾來影響基因轉(zhuǎn)錄，因而是可逆的［8］. 因此我們通過5AzaCdR人為的干預拮抗表遺傳學改變，誘導因表遺傳學改變而失活的xaf1基因表達，為去甲基化治療腫瘤提供了理論基礎.

凋亡在細胞增殖、腫瘤形成和發(fā)展中也起調(diào)控作用［9］. 我們應用不同濃度(1×103，5×103，10×103 nmol/L)5AzaCdR誘導胃癌BGC823細胞后，MTT結(jié)果顯示：細胞增殖受到明顯抑制；流式細胞儀細胞周期分析可見S期的細胞數(shù)逐漸增加，G2/M期細胞數(shù)下降，同時細胞凋亡率明顯增加呈時間和濃度依賴關系. 這一結(jié)果顯示去甲基化后能使細胞阻滯于S期，而使得進入G2/M期的細胞減少，由此推斷5AzaCdR的去甲基化作用可通過影響細胞周期而抑制胃癌細胞的增殖；同時xaf1基因去甲基化后重新表達，它可直接結(jié)合并抑制XIAP對caspase活性的抑制作用從而發(fā)揮誘導凋亡作用［2］，xaf1也是一種新的干擾素(IFN)誘導基因，其介導了IFN誘導凋亡的作用，并顯著增強了腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)誘導腫瘤細胞凋亡的作用［10］.

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篇7

inhibitory effects of  5f from pteris semiinnata  l. on proliferation of nonsmall cell lung cancer ncih460 cells

    liu yi1，wu kefeng1，li li1，george g chen2，michael ky hsin2，malcolm j underwood2，liang lianci1，3

    1. guangdong key laboratory for research and development of nature drugs，guangdong medical college， zhanjiang 524023，china；2. department of surgery，the chinese university of   hongkong，prince of wales hospital，shatin，n.t.；3.institute of biochemistry and molecular biology，guangdong medical college

    corresponding authors：liang lianci，email：plliu78@sina.comabstract：objective   to investigate inhibitory effects of 5f from pteris semiinnata l. on proliferation of nonsmall cell lung cancer ncih460 cells. methods  ncih460 cell growth inhibition mediated by 5f was detected by mtt. pihoechst double staining and tunel assay  were used to observe cell  apoptosis. flow cytometer was used to determine the effect of 5f on the content of dna in cells. results  5f displayed growth inhibitory activity against ncih460 cells with ic50 values of  21.40,4.52 and 1.02 μg/ml   at the  point  of   24, 48 and 72 hours. 5f could induce apoptosis. ncih460 cells treated by 5f were arrestet   in g2/m. conclusion  in vitro 5f  significantly   inhibited  the proliferation of ncih460 cells and the activity might   be realized through   inducing apoptosis.

    key words：pteris semiinnata l;  5f;  ncih460;  proliferation inhibited

半邊旗（pteris semiinnata l.）是生長在我國南方的傳統(tǒng)中草藥，民間用其來治療感染性疾病。從半邊旗中分離提取到一些具有生物活性的物質(zhì)，以5f含量最高，其結(jié)構(gòu)為二萜類化合物，見圖1。化學結(jié)構(gòu)名為11α羥基15氧16烯對映貝殼杉烷19酸（ent11αhydroxy15oxokaur 16en19oic acid）。本課題研究表明5f在體外能抑制多種癌細胞的生長并誘導凋亡的發(fā)生；能明顯減小k562、s180等瘤株在小鼠所形成的腫瘤大小，延長小鼠存活時間[13]。

    肺癌是目前全世界人類最主要的癌癥死因之一，其中75%～80%為非小細胞肺癌（nsnlc）， 晚期肺癌患者僅有2%存活率超過5年，通常不滿1年。近年來，對肺癌患者的治療還是以化療和放療為主導，這些治療藥物和措施會給患者帶來極大的痛苦，因此，從天然植物中提取具有抑制肺癌細胞生長的高效低毒的化合物已經(jīng)成為抗腫瘤研究的熱點。本研究旨在探討5f對非小細胞肺癌ncih460細胞生長的抑制作用及可能的機制。

    1  材料與方法

    1.1  材料

    從植物半邊旗中提取的5f，純度為100%，使用前溶于dmso。

    mtt、hoechst33342、pi為sigma公司產(chǎn)品；超級無支原體新生牛血清購自杭州四季青生物材料有限公司；rpmi1640購自美國hyclone公司；胰酶購自美國gibco公司；細胞凋亡檢測試劑盒為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

    非小細胞肺癌nci－h(huán)460細胞由本室傳代。

    1.2  方法

    1.2.1  細胞培養(yǎng)

    ncih460細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清，100ku/l青霉素和100mg/l鏈霉素的rpmi1640培養(yǎng)液中，37℃、5%  co2飽和濕度細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

    1.2.2  mtt法檢測5f對ncih460細胞的生長抑制作用

    取對數(shù)生長期的ncih460細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，rpmi1640完全培養(yǎng)液調(diào)制成2.0×104/ml細胞懸液，接種于96孔板中，每孔接種100μl（含2.0×103個細胞）。培養(yǎng)過夜后，吸出培養(yǎng)液，加入新培養(yǎng)液90μl及不同濃度的5f藥液10μl，使終濃度分別為5、10、20、40、80μg/ml。同時設置adm陽性對照組，空白對照組加入相同體積的培養(yǎng)液，每一濃度設8個平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h。每孔加入mtt(5g/l)20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4～6h。每孔加入dmso 100μl。在微型振蕩器上搖勻15min，結(jié)晶溶解后，立即比色，用elx800型酶標儀在主波長為570nm，參比波長為630處測量od值，比色以空白孔調(diào)零。實驗重復3次。

    抑制率=（1-實驗組8孔od值平均值/對照組8孔od值平均值）×100%。

    bliss方法計算半數(shù)抑制濃度ic50。

    1.2.3  熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)

    取對數(shù)生長期細胞， 調(diào)整細胞濃度為2.0×105/ml， 加1ml到預先放置蓋玻片的6孔板中， 24h待細胞爬片后， 加入不同濃度的5f藥液， 使其終濃度為5、 10、 20μg/ml， 繼續(xù)培養(yǎng)24h后， 用預冷的pbs洗滌2次， 加入hoechst33342  37℃染色15min， pbs洗滌2次， 再加入pi染色液于冰上染色15min,  pbs洗滌2次,于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

    1.2.4  流式細胞儀檢測dna含量的變化

    參照文獻介紹的方法略加改進，1 000r/min, 離心5min收集藥物處理組和對照組細胞，pbs洗滌2次，體積分數(shù)為70%的乙醇-20℃固定24h以上，pbs離心洗去乙醇后加pi染液(含50mg/l  pi，10mg/l  rnasea，0.1% tritonx100,  0.1%檸檬酸鈉和0.5%nacl),室溫下避光染色30min，400目篩網(wǎng)過濾,用epicsxl型(美國)流式細胞儀檢測dna含量，實驗重復3次。

    1.2.5  細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡

    取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞濃度為2.0×105個/ml，加1ml到預先放置蓋玻片的6孔板中，24h待細胞爬片后，加入不同濃度的5f藥液，使其終濃度為5、10、20μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，用4%多聚甲醛／0.01m pbs室溫下固定60min，余下步驟按試劑盒說明書進行操作。

    2  結(jié)果

    2.1  5f對ncih460細胞生長的抑制作用

    從表1和圖2的結(jié)果可以看出，5f能明顯抑制ncih460細胞的生長，其效果與時間和濃度相關。5、10、20、40、80μg/ml的5f在作用細胞48h后效果與陽性對照藥adm相近。5f作用ncih460細胞24、48、72h的ic50分別為：21.40、4.52、1.02μg/ml。

    2.2  熒光顯微鏡觀察5f對ncih460細胞的影響

    經(jīng)pihoechst雙染的ncih460細胞， 對照組細胞核大小較均一， 呈圓形或橢圓形， 染色質(zhì)分布均勻， 此外光下顯藍色熒光， 出現(xiàn)個別壞死細胞， 見圖3a。 而經(jīng)5f處理24h后的ncih460細胞細胞形態(tài)則出現(xiàn)不同程度皺縮， 變形， 染色質(zhì)濃縮， 部分細胞核染色體碎裂， 并有凋亡小體出現(xiàn)， 見圖3b～d。 且細胞凋亡形態(tài)出現(xiàn)的多少與5f的濃度相關。

    2.3  流式細胞儀檢測細胞dna的變化

    5f作用細胞24、48h后ncih460細胞的dna含量發(fā)生變化。隨著5f作用終濃度的增加（5～40μg/ml），g0/g1期dna出現(xiàn)含量降低，s期表1  5f對ncih460細胞的生長抑制作用表2  5f處理ncih460細胞不同時相dna含量的影響變化不明顯，g2/m顯著增加。提示5f可以將ncih460細胞阻滯在g2/m期，見表2。

    2.4  tunel法檢測5f對ncih460細胞凋亡的影響

    tunel法檢測顯示正常對照細胞不顯深棕黃色,而經(jīng)5f處理后的細胞胞核呈深棕黃色，表現(xiàn)為形態(tài)皺縮,核固縮,凝集成塊，并形成凋亡小體，其凋亡數(shù)與5f劑量呈正相關，見圖4。

    3  討論

    臨床上用于治療腫瘤的熱療、放療、化療及生物療法一直被用于殺死腫瘤細胞，隨著腫瘤的治療正朝著日益完善的綜合治療方向邁進，尤其近十幾年迅速發(fā)展的生物治療給人們帶來了新的希望，但目前化學藥物治療在臨床上依然起著重要作用。由于化療藥物的毒副作用及易產(chǎn)生耐藥性等缺陷，從天然產(chǎn)物中篩選新的高效低毒的抗腫瘤藥仍然是當務之急。本課題對半邊旗的有效活性成分及提取工藝進行了詳細的研究[46]，多年的實驗證實其二萜類提取物5f 在體外可致人的多種癌細胞死亡，主要作用機制是誘導腫瘤細胞凋亡并能抑制腫瘤細胞的遷移[79]。

    細胞凋亡(apoptosis)是細胞在其生長、發(fā)育過程中發(fā)生的一種復雜的生理和病理過程，對機體的正常發(fā)育和自身穩(wěn)定起著極其重要的作用。凋亡細胞的特征是細胞體積縮小，隨即與鄰近細胞的連接喪失，彼此脫離，失去微絨毛，胞漿濃縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張呈泡狀并與細胞膜融合，核染色質(zhì)濃縮呈塊、團，典型的為半月形，凝聚于核膜周邊，核仁裂解，進而細胞膜內(nèi)陷將細胞自行分割為多個具有完整膜性結(jié)構(gòu)，內(nèi)含各種細胞成分的凋亡小體。不少疾病(包括腫瘤)的發(fā)病與凋亡受抑制有關，許多抗癌藥物都是通過最終觸發(fā)腫瘤細胞凋亡通路達到治療的目的[6]。大多數(shù)抗癌藥物都可引起腫瘤細胞的凋亡，誘導細胞凋亡可能是抗癌藥物發(fā)揮作用的共同通路，所以細胞凋亡成為評估抗癌藥物作用能力的一項重要指標。

    細胞的生長增殖，24、48、72h的ic50分別為：21.40、4.52、1.02μg/ml，5f對其的生長抑制作用呈濃度－劑量及時間－劑量關系；熒光雙染的結(jié)果顯示經(jīng)不同濃度的5f處理24h后的ncih460細胞細胞形態(tài)出現(xiàn)不同程度皺縮，變形，染色質(zhì)濃縮，部分細胞核染色體碎裂，并伴有凋亡小體出現(xiàn)，細胞凋亡形態(tài)出現(xiàn)的數(shù)量與5f的作用濃度有關,這提示5f體外對ncih460的生長抑制作用可能與其誘導凋亡有關；流式細胞儀檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞被阻滯在g2/m期，但5f終濃度為40μg/ml時，細胞周期各時相均出現(xiàn)不同程度的改變，這可能與高濃度5f直接殺傷細胞，表現(xiàn)出細胞毒作用有關；進一步用tunel法進行凋亡檢測證實了5f抑制ncih460生長的作用是由其誘導凋亡而產(chǎn)生的。提示5f具有誘導ncih460細胞凋亡的能力，是一種值得深入研究的新型抗腫瘤候選化合物。

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目的探討夜香樹不同提取物對小鼠白血病細胞株L1210細胞的增殖抑制作用及機制。方法采用四甲基偶氮唑鹽比色（MTT）法、平板集落法和Hoechst33258熒光染色法觀察夜香樹提取物對L1210細胞的生長抑制和凋亡的影響。結(jié)果夜香樹提取物中正丁醇提取物和多糖提取物對L1210細胞有濃度依賴性的細胞毒性作用，在終濃度為62.5 μg·ml-1范圍，其正丁醇提取物和多糖提取物對L1210細胞的抑制率大于90%，IC50均小于10 μg·ml-1，夜香樹正丁醇和多糖提取物能抑制L1210細胞集落形成，并可誘導L1210細胞發(fā)生凋亡。結(jié)論夜香樹提取物對小鼠白血病細胞株L1210細胞的增殖抑制可能通過誘導L1210細胞發(fā)生凋亡而發(fā)揮作用。

【關鍵詞】 夜香樹提取物； 小鼠白血病細胞； 細胞增殖； 集落形成

Abstract：ObjectiveTo evaluate the inhibitory effect of different extracts from Cestrum nocturnum Linn..(CN) on mouse leukcmic L1210 cells and explore its mechanism. MethodsThe MTT assay， colony forming experiment and Hoechst 33258 fluorescence measurement were used to analyze the effect of extracts from CN on leukcmic L1210 cells. ResultsThe n-bulty alcohol part and polysaccharide part extracted from CN had dose-dependent effects of cytotoxicity.When the concentration was 62.5 μg·ml-1， the inhibitory rate of cells growth was above 90% and the IC50 was below 10 μg·ml-1.The inhibitory rate of cells had remarkable dose-dependence. They both could inhibit colony information and induce apoptosis of L1210 cells. ConclusionThe inhibitory effect of extracts from CN.on leukemic L1210 cells prolifertion may be related with apoptosis.

Key words：Extracts from Cestrum nocturnum Linn.； Leukemic； Proliferation； Colony forming

夜香樹，又名夜來香，茄科屬植物Cestrum nocturnum Linn.，文獻報道夜香樹提取物有抗實驗心率失常局部麻醉和中樞抑制作用［1，2］。課題組將夜香樹（以下簡稱CN）葉及嫩枝用乙醇進行滲漉提取后，浸膏以系統(tǒng)溶劑分離進行部位分離，得到CN提取物，體外培養(yǎng)小鼠白血病L1210細胞，觀察不同濃度的CN提取物對其抑制作用，初步探討其抑制作用的機制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 藥物 CN葉及嫩枝采自廣西境內(nèi)，經(jīng)本院藥用植物教研室劉壽養(yǎng)教授鑒定為茄科屬植物夜香樹Cestrum nocturnum Linn.。

1.2 受試藥物的提取及配制CN葉及嫩枝經(jīng)日曬干燥后，采用滲漉法得乙醇浸膏，浸膏用硅膠拌勻后，依次用石油醚，醋酸乙酯，水飽和正丁醇，然后用95%乙醇和50%乙醇等回流提取，回收溶劑，得CN石油醚部位、 CN醋酸乙酯部位、CN正丁醇部位、CN多糖部位。CN正丁醇部位和CN多糖部位分別用生理鹽水注射液配制成5 mg·ml-1，G6漏斗濾過除菌，4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細胞培養(yǎng) L1210細胞系小鼠淋巴細胞白血病細胞，購自上海細胞生物研究所細胞庫。將L1210細胞接種于DAB/2小鼠腹腔內(nèi)，傳代保種。臨用時處死小鼠抽取腹水，離心收集細胞，經(jīng)洗滌后用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，在含5%CO2的37℃溫箱中培養(yǎng)，每3 d傳代1次。

1.4 MTT比色法［3］檢測CN提取物對小鼠白血病L1210細胞增殖的影響取對數(shù)生長期的L1210細胞用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液配成1×104·ml-1，接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μl，每組設4個平行孔。置37℃，10%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后， 離心棄上清，實驗組分別加入最終濃度為62.5，31.25，15.62，7.81，3.90 μg·ml-1的CN提取物的培養(yǎng)液，正丁醇部位以及多糖部位的對照組則加入等體積溶劑的培養(yǎng)液，而石油醚部和醋酸乙酯部另設DMSO空白對照，加入等體積含DMSO的培養(yǎng)液；置37℃，10% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d后棄去上清液，加入200 μl /孔新鮮配制的含0. 2 mg·ml-1 MTT的無血清培養(yǎng)液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，加入200μl /孔 DMSO，振蕩混勻后，在酶標儀上以波長為550 nm，參比波長為450 nm測定OD值，測定時減去空白對照。實驗重復4次。按下式計算藥物對腫瘤細胞生長的抑制率。

腫瘤細胞生長抑制率%=(1-實驗組平均OD值/對照組平均OD值) ×100%。

1.5 集落形成實驗 取對數(shù)生長期的L1210細胞，用培養(yǎng)液配成每1 000/ml的細胞懸液，實驗組分別加入不同濃度的CN提取物 (62.5，31.25，15.62，7.81 μg·ml-1和3.90 μg·ml-1)，對照組加入等體積的溶劑。取已融化的5%瓊脂液1份，加入到9份37℃含10%胎牛血清的培養(yǎng)液中，加入到平皿，每個1ml，置室溫凝固。取預溫細胞按每9.4 ml加5%瓊脂0.6 ml混勻，加到已鋪底層瓊脂平皿中，每個1 ml。置10 % CO2，37℃條件下培養(yǎng)7 d。在倒置顯微鏡下計數(shù)含50個細胞以上的集落數(shù)，計算集落形成抑制率：集落形成抑制率（%）=(1-給藥組集落數(shù)/對照組集落數(shù))×100%。

1.6 Hoechst 33258染色法 將L1210細胞接種于10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，加96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μl。實驗組分別加入不同濃度的CN提取物，對照組加入等體積溶劑。置10%CO2，37 ℃培養(yǎng)72 h后，每孔取100 μl細胞懸液，加2 mmol·L-1Hoechst 33258 1 μl，37℃染色15 min，取40 μl滴到干凈的玻片上，加蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察(40×)，隨機計數(shù)300個細胞，計算細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.7 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)用±s，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，組間比較用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 CN提取物對小鼠白血病L1210細胞的毒性作用將濃度不同的CN提取物作用于體外培養(yǎng)的小鼠白血病L1210細胞72 h。結(jié)果見表1。

表1 CN不同提取物用MTT法對小鼠白血病L1210細胞的抑制作用（略）

*P＜0.05；**P＜0.01vs compared with the negative control group

從表1可以看出，醋酸乙酯部位對白血病細胞株L1210的抑制作用較弱，而石油醚部位對白血病細胞株L1210有一定的抑制作用，IC50為21.35 μg·ml-1，CN正丁醇部位、CN多糖部位對L1210細胞有很強的抑制率作用，IC50分別為6.97 μg·ml-1，5.85 μg·ml-1；陽性對照As2O3的IC50分別為13.40 μg·ml-1。

2.2 CN提取物對小鼠白血病L1210細胞集落形成的抑制作用 CN正丁醇部位及CN多糖部位不同濃度對L1210細胞集落形成，用As2O3 作陽性對照。結(jié)果見表2。

表2 CN提取物不同濃度對腫瘤細胞株集落形成的影響（略）

*P＜0.05；**P＜0.01vs compared with the negative control group；n=10

表2結(jié)果顯示，CN正丁醇部位、多糖部位的3個實驗劑量組對L1210細胞的集落形成均有不同程度的影響，各劑量組與陰性對照組均有顯著的差異。

2.3 CN提取物對小鼠白血病L1210細胞凋亡的影響用不同濃度的CN正丁醇部位、CN多糖部位處理L1210細胞72 h，用Hoechst 33258染色后，在熒光顯微鏡下可見凋亡細胞，細胞強藍色熒光，弱紅色熒光，在終濃度為15.62 μg·ml-1，CN正丁醇部位、CN多糖部位、陽性對照組對L1210細胞凋亡率分別為（46.26±3. 80）%，（52.21±5.31）%，（56.12±3. 9）%， L1210細胞自然凋亡率為（10.36±1.7）%。在15.62 μg·ml-1范圍，CN正丁醇部位、CN多糖部位對L1210細胞凋亡率與陰性對照組相比較有顯著性差異（P

3 討論

白血病是造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，占癌腫總發(fā)病率的5%左右，是兒童和青少年最常見的一種惡性腫瘤。目前白血病的治療大多以化療為主，其作用是全身性的，毒副作用較強，因此，尋找高效低毒、抗瘤譜廣、綜合性能又好的植物來源的抗癌藥是現(xiàn)在研究的重點。

體外抗腫瘤實驗為抗腫瘤藥物篩選過程必不可少的部分。利用體外腫瘤細胞培養(yǎng)和MTT法，以抑制腫瘤細胞增殖為活性指標，是目前一種快速、經(jīng)濟、簡便、有一定特異性的藥物篩選方法，在MTT法實驗基礎上采用集落形成能力試驗、細胞計數(shù)、蛋白質(zhì)或其他大分子物質(zhì)含量測定，能客觀地反映被測物質(zhì)的藥理作用。通過此方法，不僅可以發(fā)現(xiàn)有效的抗腫瘤藥物，而且還可以從細胞水平和分子水平對抗腫瘤機制進行研究［4，5］。

本研究中，細胞毒試驗（MTT法）實驗結(jié)果顯示，CN不同提取物對L1210細胞都有不同程度的抑制作用，且其抑制作用呈明顯的劑量關系。其中CN正丁醇部位、CN多糖部位對L1210細胞的半數(shù)致死濃度（IC50）

參考文獻

［1］ 曾 靖，黃賢華，賴 飛，等.夜來香水提取液局部麻醉作用［J］.贛南醫(yī)學院學報，2003，23（1）：1.

［2］ 曾 靖，李坊貞，葉和楊，等.夜來香正丁醇提取物的中樞抑制作用［J］.贛南醫(yī)學院學報，2003，23（3）：237.

［3］ Weitman S， Barrera H， Moora R， et al. Augumentation of antitumor activity when combined with topotecan［J］. J Pediatr Hematol Oncol， 2000， 22(4):306.

篇9

1.無公害蔬菜生產(chǎn)現(xiàn)狀分析

1.1硯山縣生產(chǎn)無公害蔬菜的優(yōu)勢

1.1.1氣候條件優(yōu)越。硯山縣地處北回歸線附近的低緯高原地帶，屬北亞熱帶季風氣候。冬無嚴寒，夏無酷暑，四季溫和的自然立體氣候（年平均降雨量在850～1400mm，氣溫在12.5～18.6℃，全年理論日照為4421小時，霜期一般在62天左右），全縣境內(nèi)四季均可生產(chǎn)無公害蔬菜。

1.1.2土地資源豐富。硯山縣的土地資源是比較豐富的，可以生產(chǎn)無公害蔬菜基地133.3hm2以上的大小壩子35個，共有面積7.07萬hm2，占全縣土地總面積的18.4%。其中，平遠、稼依壩子的面積達4.07萬hm2，是全省名列第8的大壩子。目前硯山縣生產(chǎn)無公害蔬達0.73萬hm2，占蔬菜栽種面積的10.4%。

1.1.3水資源豐富。硯山縣年總降水量40億萬m3，經(jīng)流量14億萬m3，占總降水量的35%，目前可控制水量為1.4億萬m3，占徑流量的10%。其中：有6條小河，總長224.7km；共有河道引水工程342件，攔河壩32道，泉水71處，箐溝239條。

1.1.4交通條件良好。硯山縣地處323國道線上，又是內(nèi)地向沿海地區(qū)提供蔬菜的必經(jīng)之路，在路途上遠比建水、通海等蔬菜產(chǎn)區(qū)占有優(yōu)勢。目前硯山縣由于各種原因，生產(chǎn)不出更多的無公害蔬菜，致使雖然硯山的地理位置好，區(qū)位優(yōu)勢好，交通便利，但沒有得到其應有的效應。

1.2無公害蔬菜生產(chǎn)存在的問題

近年來我國種植業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)得到不斷調(diào)整，我國蔬菜種植面積每年都處于不斷擴大的趨勢，同時也使得各類病蟲害逐年加重。需要考慮的是，我國作為一個科學技術水平相對落后的國家，在蔬菜的種植與生產(chǎn)過程中，不可能完全拒絕使用農(nóng)藥，尤其是近些年病蟲害不斷加重的情況下，不使用農(nóng)藥很可能導致減產(chǎn)、絕收。因此，我國菜農(nóng)在農(nóng)藥的使用及管理上仍然存在較大的問題，具體有以下幾點。

1.2.1農(nóng)藥經(jīng)營臺帳問題。一是部份農(nóng)藥經(jīng)營戶進貨、銷售臺帳記錄不規(guī)范、不全面；二是部份農(nóng)藥經(jīng)營戶沒做進貨、銷售臺帳記錄；三是農(nóng)藥擺放不規(guī)范；四是極少數(shù)存在不及時清理、銷毀過期農(nóng)藥。

1.2.2經(jīng)費短缺。資金不足仍然是制約農(nóng)藥監(jiān)督管理工作的主要因素。比如一年一度的年審、上崗人員的繼續(xù)培訓及材料、辦證、換證等費用都是從其它款項的費用中支出。

1.2.3農(nóng)藥市場不規(guī)范。農(nóng)藥市場分散，農(nóng)藥經(jīng)營戶多，執(zhí)法人員少，造成農(nóng)藥管理人員在農(nóng)藥管理過程中困難重重。比如：不能同時顧及外勤的農(nóng)藥市場巡查和內(nèi)勤的換證、辦證，以及材料的上報等工作（農(nóng)藥管理涉及食品安全、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量、辦證、換證、市場巡查等工作，需要上報的材料很多）。

2.植保技術在無公害蔬菜生產(chǎn)中的作用分析

2.1改善蔬菜生產(chǎn)環(huán)境、加大食品安全宣傳

選擇無公害蔬菜生產(chǎn)環(huán)境必須要提高土壤、土地的選擇標準，同時通過加強周邊水土資源管理等措施，確保農(nóng)作物用水的安全性，防止由于工業(yè)用水對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生的污染問題。其次，對于不同品種、不同特性的蔬菜，要結(jié)合其生長要求改善周邊環(huán)境，如土壤環(huán)境、水資源環(huán)境等，從而確保各項環(huán)境指標均能夠滿足無公害蔬菜的生長條件。另外，在灌溉系統(tǒng)當中，也要采用高科技的灌溉技術，確保蔬菜在用水方面得到保障。不僅如此，還應繼續(xù)大力宣傳農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全，無公害農(nóng)產(chǎn)品及綠色食品生產(chǎn)的重要意義。強化重點，樹立榜樣，重點發(fā)展龍頭企業(yè)、種養(yǎng)大戶等有規(guī)模、上檔次的企業(yè)，同時要讓每個人認識到無公害、綠色食品生產(chǎn)對環(huán)境、資源、經(jīng)濟、社會發(fā)展良性循環(huán)的重要作用。

2.2物理及生物防治技術的應用

在無公害蔬菜種植過程中，物理技術可改善蔬菜生產(chǎn)環(huán)境，通過物理手段建立一套有利于蔬菜生長的環(huán)境，通過抑制害蟲生長的物理技術來促進蔬菜的生長。物理技術主要有溫度、顏色及光線等，如采用糖醋劑、紫光燈等措施來吸引、殺死害蟲，起到減少農(nóng)藥使用乃至替代農(nóng)藥的良好效果。

生物防治技術主要是利用蔬菜生長的特性，促進蔬菜的生長，即根據(jù)蔬菜在生物鏈中的位置特點，營造出一種有利于蔬菜生長的環(huán)境。比如利用生物之間的對抗性，保證無公害蔬菜的種植與產(chǎn)量。但需要考慮的是，生物防治技術效果的體現(xiàn)需要一定的時間過渡，因此要想結(jié)合物理技術的應用，起到制約害蟲、促進蔬菜生長還有必要結(jié)合物理技術來取得較為良好的效果。

2.3強化無公害蔬菜病蟲害農(nóng)藥防治管理

一般來說，通過應用化學防治技術能夠較大規(guī)模、較好效果地實現(xiàn)病蟲害的控制及防治工作。但采用化學防治技術還應嚴格控制化學藥品的用量、時間、品種、頻率，使用最少的化學藥品，取得最佳的防治效果。此外，還應該注意化學農(nóng)藥的殘留、病蟲害發(fā)生的規(guī)律等確定化學藥品的使用，將病蟲害控制在早期階段，確?；瘜W農(nóng)藥的使用能夠體現(xiàn)出更加優(yōu)良的效果。

篇10

合作學習（cooperative learning）是一種以小組學習為形式，旨在促進學生合作，從而達到最佳學習效果的教學方法。它能改善課堂氣氛，大面積提高學生的學業(yè)成績，并且能滿足學生的心理需要，促進學生情感的發(fā)展，已經(jīng)廣泛地受到世界各國的青睞，并成為當代主流教學模式，被越來越多的教師所認可并采用。

醫(yī)學細胞生物學是我院大一新生第一學期開設的課程。由于醫(yī)學細胞生物學是一門重要的醫(yī)學基礎課程，且為后續(xù)其它的基礎醫(yī)學和臨床課程的學習搭建牢固的知識平臺，因此，熟練掌握其基礎理論、基礎知識和實驗技能，對醫(yī)學院的學生來說十分必要。

一、合作學習教學模式的必要性

1.生物學基礎知識參差不齊。

我院生源不統(tǒng)一，如護理、預防專業(yè)，招收的高中文、理科畢業(yè)生皆有，因此剛接觸學習醫(yī)學細胞生物學時，文科畢業(yè)生不太習慣這種知識體系，對學習醫(yī)學細胞生物學相對倦怠和恐懼，容易產(chǎn)生抵觸學習情緒，很大程度地影響了學習成績。

2.傳統(tǒng)的教學模式已經(jīng)不適用于新興人才的培養(yǎng)。

傳統(tǒng)的以教師為“絕對中心”、滔滔不絕的“填鴨式”教學法，使學生失去以飽滿狀態(tài)進行持續(xù)聽取整堂課的興趣，學習氣氛沉悶，學生學習的積極性和主動性得不到充分的調(diào)動和發(fā)揮，教學效果不敬人意。

合作學習教學模式以面向全體學生為原則，不僅有利于促進每個學生的發(fā)展，而且突出教學過程中學生的主體地位，能夠充分調(diào)動學生的學習積極性，增強學生的學習效果和教師教學的實效性。因此在醫(yī)學細胞生物學的教學中，以合作學習教學模式作為對傳統(tǒng)教學模式的一種突破和補充，是十分必要的。

二、合作學習教學模式在醫(yī)學細胞生物學課程中的應用

合作學習模式是一種責任分工學習模式，也是一種互助學習模式，是教師營造民主、平等的學習氛圍，通過生生互動、師生互動的交流方式，充分發(fā)揮學生的主觀能動性和學習潛能，齊心協(xié)力共同完成教學目標的一種教學模式。該模式由以下幾個步驟構(gòu)成。

1.學生自主合理劃分小組，以小組為單位收集資料（課前）。

合作學習以學生為中心，其基本教學形式是小組活動。分組采取自愿原則，但必須兼顧“組內(nèi)異質(zhì)，組間同質(zhì)”，即按照性別、興趣愛好、知識基礎、語言能力和學習能力等特征將整個班級平均分成若干組，每組6―8人。每組設一個組長，負責工作。組長可以由組內(nèi)成員輪流擔當。組內(nèi)成員有男有女，有文有理，有強有弱。這樣互補型的組內(nèi)成員優(yōu)化組合，不僅能使學生產(chǎn)生新鮮感，而且能增強學生的學生興趣。

組內(nèi)成員課前各自預習即上新內(nèi)容（如小分子的跨膜運輸），并相互協(xié)作通過課本、互聯(lián)網(wǎng)、圖書館等途徑收集即上新內(nèi)容的相關資料，達到預習的功效。

2.教師課堂進行班級集體授課，制訂教學目標（課堂20min）。

合作學習教學模式中的班級集體授課，是合作學習的一種前提準備，也是合作學習模式策略中必不可少的一個重要環(huán)節(jié)。在集體授課中，教師需要解決的任務有以下幾個。

（1）激發(fā)興趣。教師在計劃時間內(nèi)，高效講授新的課程內(nèi)容的基本點，以積極、振奮、飽滿的情緒感染學生，用影視、圖像、聲音、動畫與文字等多媒體信息進行授課，如各種小分子跨細胞膜膜轉(zhuǎn)運的動畫素材，感染學生的聽課情緒，激發(fā)學生的聽課興趣。

（2）目標設計。做好合作學習的啟動工作，根據(jù)講授內(nèi)容抓住重、難點，按照“從大到小”的原則提出在學生能力范圍內(nèi)的可操作性問題。如：“細胞膜是不是完全封閉的結(jié)構(gòu)？”“是不是所有的小分子跨膜運輸都需要膜轉(zhuǎn)運蛋白?”“小分子跨膜運輸都需要消耗ATP嗎？”“小分子物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運主要分為哪兩種？”

3.學生小組研究討論，教師走動觀察（課堂15min）。

各小組分別就所提出的問題，根據(jù)課前收集的信息和資料進行“主動參與、交流合作”的組內(nèi)研究和討論，由組長總結(jié)得出的結(jié)論。

教師在班級里走動觀察各組討論情況，及時表揚一些好的行為，鼓勵一些膽小不愛表達的同學積極發(fā)表意見，及時將一些偏離主題的同學拉回正題上來。另外，如有必要，要讓學生掌握一些必要的合作技能，如善于傾聽別人的意見，在合作學習過程中要學會尊重，如有不同意見，應先保留，等對方講完，再提出不同的見解。

這樣能使每個學生都積極、平等地參與到問題的討論中來，共同討論，共同進步，既可以從別人那里獲得寶貴知識，對所學知識產(chǎn)生深刻的認識，又能加強語言表達能力和發(fā)展人際交往能力。

4.師生共同總結(jié)工作（課堂10min）。

先由某一組組長匯報討論結(jié)果，如“小分子跨膜轉(zhuǎn)運主要有簡單擴散、協(xié)助擴散和載體蛋白耗能介導的運輸”。然后其他組組長作出評價和補充，如“簡單擴散和協(xié)助擴散屬于被動運輸方式，載體蛋白介導的耗能運輸是主動運輸方式”。最后教師進行適當?shù)恼T導和啟發(fā)，師生共同對本課所學內(nèi)容進行歸納總結(jié)，達成一致共識，得出結(jié)論：小分子跨膜轉(zhuǎn)運按照是否需要消耗能量被分為被動運輸和主動運輸。

5.建立獎勵制度（課后）。

獎勵合作學習中表現(xiàn)優(yōu)異的小組，如分工最為明確的小組、最為團結(jié)互助的小組、最具發(fā)散思維的小組、最具創(chuàng)新能力的小組、言語最為精煉的小組等，形成“組內(nèi)成員合作，組間成員競爭”的新格局，使每個同學都加強個人的責任感和團隊意識。且每次得優(yōu)的小組成員都會在平時分上加相應的分數(shù)，以資鼓勵。

三、結(jié)語

合作學習教學模式在醫(yī)學細胞生物學中的科學、合理應用，有利于學生對完整知識體系的構(gòu)建，有利于激發(fā)學生的最大程度地發(fā)揮其主動學習的潛能，有利于學生從他人的思維中獲得啟發(fā)和創(chuàng)新思維，有利于學生培養(yǎng)團結(jié)合作的精神，有利于學生整體素質(zhì)的全面提高，有利于建立和諧、平等的師生關系和生生關系，有利于教師發(fā)現(xiàn)自身存在的知識和能力不足，有利于教學質(zhì)量的不斷改進。像這樣“師生共同進步、共同分享教育成果”，才是教育的真諦。

參考文獻：